Diversidad genética, morfológica y química de colectas de Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray para la alimentación animal

J E Rivera, J F Gómez-Leyva¹, D Ramírez¹, J Chará, J G Morales², R Barahona² y T E Ruiz³

Centro para la Investigación en Sistemas Sostenibles de Producción Agropecuaria - CIPAV. Carrera 25 # 6-62, Cali, Colombia
jerivera@fun.cipav.org.co
¹ Laboratorio de Biología Molecular, TecNM-Instituto Tecnológico de Tlajomulco, México
² Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, Colombia
³ Instituto de Ciencia Animal, Cuba

Resumen

Tithonia diversifolia es un arbusto con un alto potencial para la alimentación animal, pero ha demostrado tener una alta variabilidad en su rendimiento agronómico, oferta de nutrientes y adaptación a condiciones específicas de producción. El objetivo de este trabajo fue determinar la diversidad genética, química y morfológica de materiales silvestres de T. diversifolia en Colombia y México, y así perfilar genotipos destacados para la producción animal. Partiendo de 31 materiales colectados de ambos países, se llevó a cabo un estudio de diversidad genética mediante el uso de siete marcadores moleculares ISSR y cuatro del gen del citocromo P450. Asimismo, diferencias en características químicas y en morfología fueron analizadas con estadística multivariada. Los materiales evaluados presentaron diferencias en contenido de PC (29.4% ± 3.29), EE (1.61% ± 0.67), Ca (2.31% ± 0.2), P (0.60% ± 0.18), FDA (44.9% ± 9.43) y FDN (46.8% ± 12.5) (p<0.05). Además, se encontraron diferencias en el peso total de la planta, área foliar, hojas por rama y altura de planta (p<0.05). Finalmente se identificó una amplia diversidad genética con cinco grupos bien definidos y mediana relación geográfica entre materiales, encontrándose un índice de Nei de 0.281 y un índice de Shannon de 0.432. Se concluye que T. diversifolia cuenta con una amplia diversidad fenotípica y adaptación a diferentes condiciones edafoclimáticas, y que existe la necesidad de seleccionar materiales con el fin de conservar y resguardar germoplasma con características agronómicas y nutricionales destacadas para un mejor aprovechamiento de esta especie.

Palabras clave: botón de oro, calidad nutricional, Citrocromo P450, ISSR, marcadores moleculares, variabilidad fenotípica

Genetic, morphological and chemical diversity of collections of Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray for animal feed

Abstract

Tithonia diversifolia is a shrub with great potential for animal feeding thanks to its chemical composition, edaphoclimatic adaptability and biomass production, but has shown differences in its agronomic performance and nutritional quality. The objective of this work was to determine the genetic, chemical, and morphological diversity of wild T. diversifolia materials in Colombia and Mexico, and thus outline outstanding genotypes for animal production. Based on 31 materials collected from both countries, a genetic diversity study was carried out using seven ISSR and four cytochrome P450 gene molecular markers. Likewise, differences in chemical characteristics and morphology were analyzed with multivariate statistics. The evaluated materials presented differences in their PC content (29.4% ± 3.29), EE (1.61% ± 0.67), Ca (2.31%± 0.2), P (0.60%±0.18), ADF (44.9% ± 9.43), NDF (46.8% ± 12.52), among other traits ( p <0.05). In addition, differences were found in the total weight of the plant, leaf area, leaves per branch and plant height ( p <0.05). Finally, a wide genetic diversity was identified with five well-defined groups and a medium geographical relationship between materials, finding a Nei index of 0.281 and a Shannon index of 0.432. It is concluded that T. diversifolia has a wide phenotypic diversity and adaptation to different edaphoclimatic conditions, and that there is also the need to select materials in order to conserve and protect germplasm with outstanding agronomic and nutritional characteristics for a better use of this species.

Keywords: Citrochrome P450, ISSR, Mexican Sunflower, molecular markers, nutritional quality, phenotypic variability

Introducción

Tithonia diversifolia (Hemsl.) A. Gray popularmente conocida como botón de oro, falso girasol o girasol mexicano, es un arbusto perenne de la familia Asteraceae, nativo de México y América Central pero ampliamente distribuido en Asia, África, América del Sur e islas del Caribe (Obukohwo y Umar 2014; Miranda et al 2015; Luo et al 2016). A pesar de ser considerada una planta pionera e invasora que puede afectar el crecimiento de otras especies (Oludare y Muoghalu 2014; Luo et al 2016), se han identificado propiedades farmacéuticas derivadas de sus numerosos metabolitos secundarios como sesquiterpenoides, diterpenos, fenoles y flavonoides (Lifongo et al 2014; Ejelonuet al 2017), algunos con propiedades insecticidas o herbicidas (Kolawole et al 2011, Miranda et al 2015). También como especie se ha empleado en rehabilitación de suelos, protección de taludes, biorremediación, producción de abono verde y uso apícola bajo diferentes condiciones (Mustonen et al 2015).

Gracias a sus bajos valores de fibra detergente ácida (FDA) y neutra (FDN), alto contenido de proteína cruda (PC) y minerales, y alta digestibilidad y contenido de carbohidratos no estructurales, T. diversifolia es una especie que posee un alto potencial para la alimentación animal y la disminución de emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) (Ribeiro et al 2016; Mauricio et al 2017). Además, T . diversifolia presenta una gran adaptabilidad edafoclimática y una alta producción de biomasa (Ramírez-Rivera et al 2010; Ribeiro et al 2016), con alta variabilidad en su capacidad de rebrote, desempeño agronómico, composición química y de adaptación, debido probablemente a su alta diversidad genética (Yang et al 2012; Ruiz et al 2013; Luo et al 2016; Gallego et al 2017).

Actualmente en Colombia y en otros países donde se ha usado esta especie, no se tiene un registro de la diversidad genética de las poblaciones naturales de T. diversifolia, lo que dificulta planificar y diseñar estrategias de conservación y manejo, así como para la selección de líneas de germoplasma y el mejoramiento genético de esta especie (Ruiz et al 2013; Tabin et al 2016; Luo et al 2016). La diversidad genética, que revela el grado de polimorfismo entre diferentes poblaciones e individuos, es un patrón para medir el potencial evolutivo y la capacidad de adaptación de las especies (Chai et al 2014). Dentro de las evaluaciones de diversidad genética, el marcador de Secuencias Intergénicas Repetidas Simples (ISSR) se ha perfilado como una buena herramienta debido a su alta repetitividad, alto polimorfismo, bajo costo y fácil manejo (Kalpana et al 2012; Yang et al 2016).

El objetivo del presente estudio fue determinar la diversidad genética, morfológica y bromatológica de materiales silvestres de T. diversifolia por medio del uso de marcadores ISSR y citocromo P450 en colectas de Colombia y México, y así perfilar orígenes con un mayor potencial para la alimentación animal en ambos países debido al uso que esta especie ha tenido durante los últimos años.

Materiales y métodos

Sitios de colecta

Se identificaron poblaciones silvestres con antecedentes de uso como forraje (Tabla 1) donde se colectaron hojas jóvenes y se almacenaron a -20ºC hasta su análisis. Se utilizó una matriz de calificación que incluyó 100 sitios previos los cuales fueron calificados teniendo en cuenta características como: facilidad de acceso, área establecida, representatividad de las condiciones de producción (tipo de suelo y medio ambiente), tipo de semilla usada para el estavlcimiento (sexual o por estaca), origen del material usado en las siembras y comportamiento productivo, con el propósito de identificar de manera representativa los mejores sitios de colecta.

Un total de 82 muestras de T. diversifoliafueron colectadas en los 31 sitios seleccionados a partir de los 100 lugares inicialmente incluidos en la evaluación, distribuidos en Colombia y México (Figura 1). En Colombia, las colectas se realizaron en las ecorregiones del Eje Cafetero (EEC), Valle del Río Cesar (EVRC), Piedemonte Orinocense (EPO), Bajo Magdalena (EBM), Caquetá (CAQ), y Santander y Boyacá (ESB); y en México en los estados de Michoacán (MICH) y Jalisco (JAL). La asterácea Heliopsis longipes (A. Gray) fue incluida en el análisis a manera de control. Las colectas de Colombia en realizaron en sitios representativos donde tradicionalmente se ha utilizado esta arbustiva como alimentación animal y con diversidad de condiciones biofísicas y en México la toma de muestras se hizo en dos de los estados donde desde hace algunos años T. diversifolia se ha usado en los sistemas bovinos de producción.

Figura 1. Localización de los sitios de colecta de T. diversifolia en Colombia y México

Extracción y procesamiento de ADN

Para la extracción de ADN se usó el kit comercial DNeasy Plant mini Kit (Qiagen ®). La evaluación de la calidad del ADN se realizó mediante geles de agarosa al 0.8% corridos en tampón TBE 1X (Tris 0.089 M, ácido bórico 0.089 M y EDTA 0.002 M) a 80 voltios durante una hora y teñidos con Bromuro de etidio (10 mg/ml). Las concentraciones de ADN y la relación A260/A280 se determinaron mediante el uso de Nanodrop (Thermo Scientific ®). Estos trabajos fueron realizados en el Laboratorio de Fitotecnia Tropical de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín (Colombia) y en el Laboratorio de Biología Molecular del Instituto Tecnológico de Tlajomulco (México).

Determinación de la diversidad genética mediante marcadores moleculares y análisis ITS

Para la amplificación de los fragmentos, se evaluaron 45 iniciadores, de los cuales 11 fueron seleccionados (Tabla 1), siete oligos ISSR y cuatro para el gen citocromo P450 (Yamanaka et al 2003). Las amplificaciones de PCR se realizaron en un volumen de 12.5 ml que contienen Tris-HCl, 10 mM (pH 9.0), KCl 50 mM, MgCl ₂ 2.0 mM, dNTPs 0.20 mM, gelatina 0.1 %, 5 μM de cada oligo, 0.5 U de Taq DNApolymerasa (Fermentas), y 20 ng de DNA genómico. Las condiciones del proceso fueron: termociclador SelectCycler, programado para un primer ciclo térmico de 4 min a 94^oC, seguido por 35 ciclos correspondientes a la desnaturalización (1 min a 94^oC), alineación del iniciador 46 - 56 ^oC por 1 min (acuerdo al oligo, Tabla 2) y elongación a 72^oC por 2 min. Posteriormente, el producto se mantuvo a 72^oC por 7 min para luego ser conservado a 4^oC.

Con el fin de confirmar la identidad de las muestras, se amplificó la región ITS del DNA ribosomal empleando los oligos ITS1 5’ AGGAGAAGTCGTAACAAGGT 3’ e ITS4 5’ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’. Los productos amplificados fueron purificados y secuenciados en un secuenciador automático Applied Biosystem empleando los mismos oligos. Las secuencias obtenidas fueron comparadas con las de la base de datos del NCBI (National Center for Biotechnology Information) empleado el algoritmo BLASTn. (Basic Local Alignment Search Tool. https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

Los productos de amplificación con los marcadores ISSR y del citocromo P450 fueron separados por electroforesis en geles de agarosa al 1.2% en amortiguador SB 1X (borato de sodio 10 mM, pH 8.5) a 100 voltios, teñidos con bromuro de etidio y visualizados en un fotodocumentador UV. Los patrones de amplificación se registraron en una matriz binaria de presencia (1) y ausencia (0) con la ayuda de software Gel Analyzer^®. La similitud genética entre los individuos se calculó utilizando el coeficiente de similitud de Dice.

Análisis bromatológico

Las determinaciones químicas fueron: proteína cruda (PC), cenizas (Cen), fibra en detergente neutra y ácida (FDN y FDA), grasa (EE), Calcio (Ca), Fósforo (P) y Hierro (Fe). El porcentaje de N y PC se determinaron por el método de Kjeldahl según NTC 4657 (ICONTEC 1999), FDN y FDA según la técnica secuencial de acuerdo con AOAC 2002.04 y 973.18 respectivamente (AOAC 2005), y EE por extracción Soxhlet por inmersión (NTC 668- ICONTEC 1973). Finalmente, el contenido de cenizas se determinó por incineración directa en una mufla a 500°C según AOAC 942.05 (AOAC 2005) y el contenido de los minerales Ca, P y Fe y por espectrofotometría AA y UV- VIS basado en NTC 5151 (ICONTEC 2003) y 4981 (ICONTEC 2001).

Determinaciones morfológicas

Las medidas morfológicas evaluadas fueron: peso de las hojas (g), peso de los tallos (g), número de hojas por planta, número de ramas por planta (#), altura de la planta (cm), diámetro de los tallos (mm), relación hoja/tallo y área foliar (cm²).

Análisis de la información

El análisis de agrupamiento se realizó por el método UPGMA (unweighted pair-group method) y se generó un dendrograma utilizando el paquete estadístico NTSYS (Numerical Taxonomy System for personal Computer, versión 2.02 PC). Para cada oligo o su combinación se calculó el número de alelos observados y efectivos, (Na, Ne), número de bandas polimórfica (P), índice de diversidad genética de Nei (H) e índice de Shannon (I) empleando el software POPGENE versión 3.2 (Yeh et al 1997).

La probabilidad de encontrar un individuo dentro de un grupo dado fue analizada empleando una aproximación Bayesiana del programa STRUCTURE 2.3.3 (Pritchard et al 2000). El número de posibles poblaciones (K) fue establecido de 2 a 10, realizando un análisis de 100,000,000 iteracciones y una cadena de Monte Carlo Markov Chain (MCMC) de 1,000,000, usando un modelo no mezclado y frecuencias alélicas. El número de K poblaciones fue definido por el valor de delta-K (Earl y VonHoldt 2012).

Los resultados químicos, de morfología y aspectos agronómicos se analizaron por métodos multivariados, mediante un análisis de componentes principales (ACP) y gráficas Biplot. Estos análisis fueron llevados a cabo en el entorno r (R Core Team 2023) usando la librería “FactorMiner”, “Vegan” y“Agricolae”.Estas características fueron evaluadas en plantaciones de 40 días pos-corte y empleando cinco plantas por sitio.

Resultados

Diversidad e identificación genética de las colectas de T. diversifolia

La concentración promedio de ADN purificado fue de 168 ± 56 ng/μl y la relación A260/A280 fue de 1.81 ± 0.04, evidenciando una concentración adecuada y una buena pureza del ADN (Turashvili et al 2012). De un total de 105 fragmentos amplificados, 5% fueron monomórficos y 95% polimórficos. El tamaño de los fragmentos de ADN, productos de la PCR varió desde los 300 hasta 2500 pb (Figura 2) y las medidas de variación genética se presentan en la Tabla 3.

Figura 2. Gel de agarosa al 1.2% mostrando los productos de amplificación para los marcadores moleculares de T. diversifolia. A) ISSR (GA)8YT, B) citocromo P450 CYP1A1F/heme2B6

La cantidad de alelos efectivos en los cebadores ISSR estudiados varió de 1.0 a 1.9. Esta medida proporciona información complementaria a la diversidad genética de Nei y los valores de diversidad (H) mostraron un total de 6.0% a 48.8% de heterocigosidad. Del mismo modo, los índices de información de Shannon (I) fueron 0.13 a 0.67, representando una medición de diversidad genética con un promedio de 0.432 ± 0.23 (Tabla 3) indicando el alto polimorfismo en T. diversifolia.

Se destaca que el conglomerado tuvo una correlación cofenética alta (0.87) y un coeficiente de aglomeración de 0.8, lo cual significa una alta correspondencia entre grupos y diferencia entre los mismos. El análisis de las secuencias en la base de datos del NCBI mostró un porcentaje de homología del 99.9% en la región ITS de DNA ribosomal con lo que se confirma plenamente la identidad de estos materiales colectados.

Figura 3. Dendrograma generado por el método de UPGMA para las 31 colectas de T. diversifolia de México y Colombia empleando el índice de disimilitud de Dice

Estructura genética

En la Figura 4 se observa la estructura genética de las 31 colectas de T. diversifolia evaluadas y de H. longipes. Para T. diversifolia , el análisis basado en la proporción del genoma de cada población mostró 5 grupos bien definidos los cuales coinciden con el agrupamiento obtenido en el análisis de conglomerados (Figura 3).

El programa STRUCTURE fue utilizado para analizar los datos generados con los ISSR y el citocromo P450, en las 31 poblaciones de T. diversifolia y en H. longipes. El programa utiliza un modelo de agrupamiento basado en un modelo estadístico Bayesiano usando datos genotípicos de marcadores no ligados. Una de las aplicaciones consiste en demostrar la presencia de una estructura poblacional, identificando distintas subpoblaciones genéticas asignando individuos a subpoblaciones (Figura 4). Para este propósito, se asume un modelo en el cual existen K poblaciones, cada uno de los cuales es caracterizado por un set de frecuencias alélicas en cada locus. Los individuos son asignados probabilísticamente en la población al cual presentan mayor posibilidad de pertenencia que dentro de los grupos generados los loci estén en equilibrio Hardy-Weinberg y equilibrio de ligamiento. Usando en el análisis de estructura el modelo puede asumir que la población i ha heredado una fracción de su genoma del grupo K.

Como se observa la Figura 4, los grupos generados coinciden con el dendrograma en el cual se observa una diferenciación clara entre las poblaciones de Colombia con cuatro grupos y México con dos grupos.

Figura 4. Estructura genética de las colectas realizadas en Colombia y México K=9 1: 1EEC; 2: 268EPO; 3: 1416EPO; 4: 1EPO; 5: 2583EEC; 6: 2388EEC; 7: 953EEC; 8: 1250EVRC; 9: 1716EVRC; 10: 225ESB; 11: 2785ESB; 12: 2529ESB; 13: 1CAQ; 14: 2CAQ; 15: 3CAQ; 16: 1BOY; 17: 3700EBM; 18: 1ESB; 19: 1EVRC; 20: 2ESB; 21: 1-1EEC; 22: 1EEC-UNAL; 23: 1ESB-Carr; 24: 1250EVRC; 25: 1EEC-SENA; 26: 1MICH; 27: 2MICH; 28: 3MICH; 29: 1JAL; 30: 4MICH; 31: 2JAL; 32: H. Longipes

Composición química y características morfológicas

Al evaluar los valores máximos y mínimos, coeficientes de variación y desviaciones estándar, se observa gran variación entre colectas para las medidas tomadas. Los parámetros morfológicos (Tabla 4) que presentaron diferencias fueron: peso total de la planta ( p <0.0001), peso de las hojas ( p <0.0001), peso de los tallos (p<0.0001), número de ramas ( p <0.003), peso de las ramas ( p =0.013), hojas por rama ( p =0.001) y área foliar (p=0.006); y las características: número de hojas ( p =0.062), altura de planta ( p =0.119), diámetro de los tallos (p=0.121) y la relación hojas tallos ( p =0.066), no mostraron diferencias. En la Figura 5 se muestra la relación de las variables químicas y morfológicas con cada una de las colectas.

En las variables morfológicas evaluadas, los dos primeros componentes del ACP representaron el 77.3% de la variabilidad total. El primer componente, representó el 47.1% de la variabilidad y las características con mayor contribución fueron diámetro del tallo (23.7%), peso de los tallos (20.4%), relación hoja/tallo (20.3%) y altura de la planta (17.1%); en el segundo componente, que representó el 29.7% de la variabilidad, las características con mayor contribución fueron el número de hojas (33.8%), número de ramas (31.1%) y el área foliar (18.1%) (Figura 5). En las evaluaciones químicas, los tres primeros componentes representaron una alta variabilidad (76.4%). En el primer componente que representó el 41.1%, las variables cenizas (16.5%), PC (15.8%) y fósforo (13.9%) fueron las de mayor contribución; en el componente 2 (22.2%) las variables FDN y FDA fueron las de mayor contribución y en el tercer componente las variables de mayor contribución fueron ELN y Zinc.

Figura 5. Análisis de componentes principales de las características evaluadas: A) características químicas (Izquierda); B) características morfológicas (Derecha), de las colectas de T. diversifolia

Las colectas de la EEC tuvieron mayor peso de las plantas, peso total de las hojas y peso de los tallos describiendo valores de 3453, 1237 y 2216 g en promedio, respectivamente (p< 0.0001). Por otro lado, las plantas de la ESB y EEC mostraron mayor número de hojas (696 y 428, respectivamente) y las plantas de las regiones que presentaron menores valores para este parámetro fueron las de CAQ y EPO con valores en promedio de 271.5 y 170.7 hojas, respectivamente (p <0.0001). Con relación al número de ramas por planta, las colectadas en la ESB (39.3) fueron las de mayor número al igual que las de la CAQ (30.7). Finalmente, las plantas de las regiones EPO (253 cm²) y EEC (220 cm²) fueron las que tuvieron mayor área foliar y las de menores valores fueron las de ESB y EVRC con 126 y 123 cm², respectivamente.

En cuanto a la composición química (Tabla 5), según los coeficientes de variación encontrados para las fracciones analizadas, Cen, EE, Ca y Zn fueron los parámetros de mayor dispersión. Se identificó que los materiales de la EVRC tuvieron mayor cantidad de proteína cruda en sus hojas (34.5%), en cuanto a FDN y FDA no se encontraron diferencias entre las plantas de las diferentes zonas debido a su gran dispersión y para Ca y P los materiales de CAQ fueron los que presentaron los valores más bajos (1.7 y 0.42%, respectivamente).

Discusión

Hasta ahora, la mayor parte de los estudios sobre T. diversifolia orientados hacia la alimentación animal, se han centrado en la evaluación de campo y el análisis de rasgos fenotípicos (Ruiz et al 2013; Mauricio et al 2017), razón por la cual los resultados obtenidos en este estudio tienen implicaciones en la generación de nuevo conocimiento para esta especie y para la implementación de futuros programas de selección y mejoramiento orientados hacia la alimentación animal.

La diversidad genética mediante el uso de marcadores ISSR y del P450 gen fue adecuada para el análisis de diversidad genética y estructura debido a que logró discriminar de buena forma los genotipos evaluados (Pradeep et al 2002). Este último marcador es empleado por primera vez para esta especie por lo que se abre una nueva estrategia de análisis. La estructura genética mostró claramente la existencia de grupos homogéneos que pueden ser empleados como un criterio de selección de materiales con fines de mejoramiento y adaptación a cada condición edafoclimática. Estudios anteriores han mostrado que T. diversifoliacuenta con gran diversidad fenotípica, variabilidad que ha favorecido su productividad, composición nutricional y adaptabilidad a diferentes condiciones de producción (Yang et al 2012; Luo et al 2016). Estos aspectos han sido evaluados por autores como Ruíz et al (2010) y Holguín et al (2015), los cuales identificaron que esta especie puede variar considerablemente en su capacidad de rebrote, desempeño agronómico y composición química.

Diversidad genética

El análisis de agrupamiento UPGMA (Figura 3), separó significativa los materiales de México y Colombia, observándose muestras similares sólo a nivel de región. Por ejemplo, las muestras como de MICH, CAQ y JAL resultaron homogéneas entre sí, pero distantes a las demás colectas, y los orígenes de regiones como EEC, EVRC y ESB estuvieron distribuidos en los diferentes grupos de Colombia. A un índice de disimilitud de 0.6 se lograron establecer 6 grupos. Es importante destacar, que la técnica empleada en este estudio mostró un alto grado de polimorfismo y sensibilidad para la discriminación de orígenes. Además, según índice de Hubert se formarían cuatro grupos a un corte de disimilitud de 0.8.

En estudios realizados en México, Del Val et al (2017) evaluaron 20 materiales con propósitos alimenticios provenientes de ocho localidades, obtuvieron en total 157 bandas de las cuales 33 fueron monomórficas y 124 polimórficas, lo que indica un 79% de polimorfismo. El tamaño de los fragmentos de DNA producto de la PCR varió de 170 hasta 1450 pb, y se encontró gran variabilidad entre los orígenes estudiados. Tal es así que en el dendrograma realizado con el coeficiente de Dice y mediante el método de clasificación de UPGMA no se encontró una relación significativa entre 10 muestras y solo dos resultaron similares (a un nivel de similitud de 1.47 se observaron 2 grupos).

Por otro lado, Yang et al (2012) encontraron gran variabilidad genética en colectas de esta especie obtenidas en cuatro regiones de China y dos de Laos. En esta investigación, los valores medios de Nei de diversidad genética (H) y el índice de Shannon de diversidad (I) fueron 0.294 y 0.431, respectivamente, y se observó un 84.6% de polimorfismo demostrando amplia diversidad en materiales de T. diversifolia y confiriéndole gran adaptación a diversos ambientes.

Los materiales de Caquetá evaluados en este estudio, por ejemplo, formaron un grupo homogéneo (color amarillo) a excepción del material 3CAQ, el cual muestra un grado de semejanza cercado al 33% con relación al grupo de color morado. Así mismo los orígenes 1-1EEC, 1EEC-UNAL, 1ESB-Carr, 1250EVRC y 1EEC-SENA (color verde azul) se agruparon, los cuales son colectas silvestres a borde de carretera tomadas en diferentes zonas de Colombia. Es importante destacar que los materiales de México se agruparon homogéneamente en dos grupos, especialmente los provenientes de Michoacán (color aguamarina), ya que 2JAL-Mex presenta cierto grado de hibridación o de cruzamiento dentro del grupo de Jalisco incluyendo un origen de Michoacán (color café), evidenciando cruzamiento de materiales entre estas zonas.

Finalmente, el grupo genético más grande estuvo conformado por 17 colectas (color morado); este grupo estuvo conformado por materiales de orígenes EEC, EPO, EVRC y ESB. Dentro de este grupo se presentaron tres materiales con un grado de cruzamiento importante pero muy similar entre ellos, observándose el traslado de materiales entre regiones (2583EEC, 2388EEC y 953EEC). Este estudio mostró una relación significativa entre las colectas de diferentes regiones a nivel de país. Además, se identificaron poblaciones muy homogéneas y con un perfil genético diferente al de otras poblaciones, demostrando gran diversidad en la especie T. diversifolia

Composición bromatológica y morfológica

T. diversifolia se ha utilizado a través de experimentos como forraje de alta calidad que puede reemplazar concentrados en rumiantes o incrementar la producción animal cuando es ofrecido en dietas basadas en pasturas tropicales (Ramírez-Rivera et al 2010; Ribeiro et al 2016). En todos los casos encontrados en este estudio, se lograron observar altos porcentajes de PC en las hojas (> 25%), bajos contenidos de fibra (FDA y FDA) y aceptables contenidos de minerales. Los resultados de este estudio son acordes a lo reportado por investigadores como La O et al (2009), Ribeiro et al (2016) y Mauricio et al (2017).

Para PC, valores expresados como porcentaje de la materia seca (MS), son tan altos como los observados en algunas leguminosas tropicales como Stylosanthes guianensis (18.2 %, Morgado et al 2009), Arachis pintoi (19.7%, Khan et al 2013) y Gliricidia sepium (18.3%, Silva et al 2017), y son superiores a los observados en la mayoría de las gramíneas tropicales, como Urochloa brizantha (9.3%, Ribeiro et al 2017), Cynodon plectostachyus (9.23%, Montoya et al 2017) y Megathyrsus maximus(9.3%, Carvalho et al 2017). Además, FDN y FDA fueron menores que los valores comunes observados para forrajes tropicales (Souza et al 2007), aspecto que no limita el consumo voluntario, la degradabilidad de los nutrientes y su adecuado aprovechamiento por parte de los animales.

Esta planta ofrece altas contenidos de nitrógeno debido a que puede establecer simbiosis asociativas con una amplia variedad de especies fijadoras de N que colonizan la superficie radicular de plantas no leguminosas (Reinhold- Hurek y Hurek 2011). Entre estos, se han identificado los endófitos fijadores de N y organismos diazótrofos libres (Baldani y Baldani 2005), los cuales, por sus características podrían ser los causantes de las altas cantidades de N en especies como T. diversifolia. Estas asociaciones igualmente pueden favorecer factores de crecimiento en las plantas, ayudando a un mayor desarrollo de los sistemas radiculares, mayor absorción de nutrientes y mayor capacidad de contrarrestar enfermedades (Santi et al 2013). Los valores de N tradicionalmente reportados en T. diversifolia coinciden con lo encontrado en esta evaluación (>25% de PC).

La composición química de T. diversifolia observada en este estudio pueden ser la causa de que su consumo incremente la producción animal o mejore la eficiencia de los sistemas. Por ejemplo, Ribeiro et al.(2016), evaluaron los efectos de la sustitución de la caña de azúcar fresca y concentrados por T. diversifolia (0, 6, 4, 15%) en vacas lactantes, reportando que es posible reemplazar la caña de azúcar (20% de la MS) y concentrado (11.2% de MS) sin ningún cambio en la ingesta total (18.7 kg MS/día), rendimiento de leche (22.9 kg/día) y su composición. Además, la inclusión de T. diversifolia no afecta negativamente a los parámetros de glucosa, urea, triglicéridos, colesterol, ácidos grasos no esterificados y ß-hidroxibutirato.

De igual forma en Colombia, Rivera et al (2015) al comparar un sistema de monocultivo de U.brizantha y un sistema con T. diversifolia (4000 arbustos/ha), encontraron que con este último se incrementó la producción de leche (Kg/vaca/día o Kg/ha/día), los sólidos no grasos (kg/vaca/día o kg/ha/día) y los sólidos totales (kg/vaca/día o kg/ha/día). La producción diaria de leche por vaca con T. diversifolia fue de 4.92 kg, 7% más que el sistema con U.brizantha. Además, la capacidad de carga aumentó 32%, se incrementaron los ingresos al agricultor en un 25% y también se alcanzaron beneficios para la industria lechera, ya que hay un mayor volumen de leche con contenido más alto de sólidos y menos estacionalidad en la producción a lo largo del año.

En cuanto a características morfológicas, las variables de mayor peso en el análisis de componentes principales fueron número de tallos, peso de las ramas y diámetro del tallo, razón por la cual estas características pueden servir como parámetros de selección. Para Ruiz et al (2010), estas características son importantes para determinar el rendimiento de crecimiento de materiales en especies como T. diversifolia.Según los valores encontrados en este estudio, en general, en el germoplasma evaluado existe probablemente material disponible con potencial para la producción de biomasa tanto para zonas altas y frías como para cálidas, bajas y con pH ácidos.

Según los valores de peso de las hojas y peso de las ramas encontrados en este estudio, se puede considerar que T. diversifolia es de alta productividad de biomasa, lo que junto con sus cualidades químicas convierte a T. diversifolia en un arbusto de gran valor alimenticio para animales (Mauricio et al 2017).

Conclusiones

Se reporta por primera vez la diversidad genética de una colección de T. diversifolia presente en Colombia con la estructura genética de por lo menos cuatro grupos y dos claramente diferentes en México.Los resultados encontradosevidencian que T. diversifolia cuenta con un alto potencial para la alimentación animal bajo diferentes condiciones ambientales, porque ofrece altos contenido PC (>25%) y minerales como Ca y P. Además, posee bajas concentraciones de FDN y FDA (49 y 46%, respectivamente) y alta adaptabilidad. De acuerdo con los resultados encontrados esta especie tiene una amplia diversidad genética en Colombia y México, afectando características morfológicas y químicas. Debido a lo anterior, es posible seleccionar materiales con mayor rendimiento, calidad nutricional para la alimentación animal y con gran adaptabilidad edafoclimática como por ejemplo los materiales de la EEC. Según los presentes resultados, se recomienda avanzar en evaluaciones de adaptación e interacción genotipo x ambiente donde todos los genotipos sean evaluados bajo las mismas condiciones y así identificar aquellos con mayor potencial forrajero para ser usados en ecosistemas particulares.

Agradecimientos

Los autores agradecen al proyecto Ganadería Colombiana Sostenible, financiado por el Gobierno del Reino Unido y el Fondo Mundial para el Medio Ambiente, por aportar recursos necesarios para las evaluaciones y recolección de materiales. También, los autores agradecen al Instituto Tecnológico de Tlajomulco (México), especialmente a su Laboratorio de Biología Molecular y estudiantes, al laboratorio de Fitotecnia Tropical de la Universidad Nacional de Colombia (Sede Medellín) por ofrecer sus instalaciones y otros recursos para las evaluaciones a nivel molecular, así como a Colciencias en su convocatoria de Doctorados Nacionales 727 de 2015.

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