Actividad probiótica de Lactobacillus plantarum en los indicadores bioproductivos y de salud en lechones

R R Vera Mejia, E Vega Cañizarres¹, C Bulnes, F Agüero Diaz¹, M D Zambrano Aguayo y L Sánchez Miranda¹

Universidad Técnica de Manabí (UTM). Avenida Urbina y Che Guevara, Portoviejo, Manabí, Ecuador
ronaldvm04@gmail.com
¹ Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA). Carretera de Jamaica y Autopista Nacional, Apdo.10 San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba

Resumen

El objetivo del presente estudio fue evaluar la actividad probiótica de Lactobacillus plantarum 22 LMC en lechones. Se utilizó un diseño de bloques al azar con tres tratamientos, dos grupos tratados con lactobacilos (1x10⁹ y1x10¹⁰ UFC/mL) y un grupo control sin probiótico. En cada tratamiento se utilizaron dos cerdas con sus crías Landrace x Pietraim. Se suministró el probiótico por vía oral a los lechones, el primero, tercero y décimo cuarto día de edad, a partir de los 15 días se mezcló con el alimento hasta los 65 días de edad. Se determinaron los indicadores bioproductivos, de salud y microbiológicos.

Se mejoraron los indicadores como el peso final y la ganancia media diaria (p ≤ 0. 05). Se redujo la incidencia de diarreas en los grupos tratados con respecto al grupo control. En los estudios morfométricos de los órganos se observó un incremento del peso relativo (p ≤ 0. 05), del hígado, bazo, timo y mayor desarrollo en el intestino delgado (p ≤ 0. 05), relacionado con la altura de la mucosa, altura y grosor de las vellosidades y profundidad de las criptas de los animales tratados.

No se observaron alteraciones en los indicadores hemáticos y decreció el conteo de coliformes totales en el contenido cecal (p ≤ 0. 05), de los lechones tratados. Se concluye que L. plantarum mejora los indicadores bioproductivos y de salud en los lechones.

Palabras clave: antimicrobianos, coliformes, colonización, morfometría

Probiotic activity of Lactobacillus plantarum on the bioproductive and health indicators in piglets

Abstract

The objective of this study was to evaluate the probiotic activity of Lactobacillus plantarum 22 LMC in piglets. A randomized block design was used with three treatments, two groups treated with lactobacilli (1x10⁹ and 1x10¹⁰ UFC/mL) and a control group without probiotic. In each treatment two sows with their young Landrace x Pietraim piglets were used. The probiotic was given orally the first, third, and fourteenth day of piglet age, and after the fifteenth day, it was mixed with food until they were 65 day old. The bioproductive, health and microbiological indicators were determined.Indicators such as final weight and average daily gains were improved (p ≤ 0. 05); incidence of diarrhea was reduced in the treated groups compared with the control group. In the morphometric studies of the organs, an increase in relative weight (p ≤ 0. 05) of the liver, spleen, and thymus and a greater development in the small intestine (p ≤ 0. 05), related to the height of the mucosa, height and thickness of the villi, and depth of the crypts, were observed in the treated animals. No alterations of blood indicators were observed, and the total coliform count in the cecal content (p ≤ 0. 05) of the piglets treated decreased with respect to the control group. It was concluded that L. plantarum improved the bioproductive and health indicators in piglets.

Keywords: antimicrobial, coliform, colonization, morphometry

Introducción

Durante décadas, los antibióticos se utilizaron en la producción animal como agentes terapéuticos y como aditivos promotores del crecimiento para incrementar los rendimientos productivos (Cajarville et al 2011). Sin embargo, su uso creó serios problemas de resistencia microbiana y se agudizó la aparición de efectos residuales en los alimentos para el consumo humano (Cajarville et al 2011).

Por tales razones, se requirió la introducción de otros aditivos en las prácticas de alimentación y manejo como los probióticos para que contribuyeran a eliminar los efectos negativos del uso de antibióticos (Giraldo-Carmona et al 2015).

El empleo de un nuevo probiótico en la práctica veterinaria requiere de su evaluación previa. Después de caracterizar y seleccionar los microorganismos con actividad probiótica in vitro, es importante demostrar in vivo su capacidad probiótica (Martins et al 2012). Por lo que el objetivo de la investigación fue evaluar la actividad probiótica de L. plantarum 22 LMC en lechones.

Materiales y métodos

Elaboración del biopreparado bacteriano

Se empleó una cepa de L. plantarum 22 LMC procedente del laboratorio de biología molecular de la Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí, Ecuador (ESPAM), aislada del intestino de cerdos criollos y caracterizada in vitro sus propiedades probióticas por Vera et al (2018).

Se elaboraron 20 L del biopreparado en un medio de producción nacional compuesto de melaza (1.26%), autolizado de levadura (0.36%), suero de leche (3.0%) a pH 6.5. Para ello se prepararon cuatro frascos de 5L con 4L del medio de cultivo.

Como inóculo se partió de colonias de L plantarum 22 LMC crecidas en caldo Mann Rogosa Sharp (MRS, Difco^TM EUA) a 37°C durante 18-20 horas. Como volumen de inoculación se empleó el 10% del volumen final.

Todos los frascos se incubaron a 37^°C durante 32- 48 horas en condiciones estáticas. Después de este tiempo, se realizaron los conteos de viables y la medición del pH, para comprobar la calidad y la concentración de los biopreparados.

Se envasaron en frascos estériles de un litro a dos concentraciones 1x10 ⁹ y 1x10¹⁰ UFC/mL y se conservaron a 4-8ºC hasta su utilización.

Tratamientos experimentales

El trabajo se desarrolló en la Unidad de Docencia, Investigación y Vinculación, Hato Porcino de la Escuela Superior Técnica Agropecuaria de Manabí (ESPAM) ubicada en el Campus Politécnico, sitio El Limón, Cantón Bolívar, Provincia Manabí, Ecuador, situado geográficamente entre las coordenadas 0º 49᾿27” Latitud Sur, 80º 10᾿47” Longitud Oeste con una elevación de 15 m sobre el nivel del mar. Temperatura de 21^ºC ± 0,5 precipitación anual 74.8 mm.

Se utilizó un diseño completamente al azar con 57 lechones distribuidos en tres tratamientos con un peso promedio al nacimiento de 0.83 ± 0.02 kg. Las condiciones de manejo y tenencia de los animales se realizaron basadas en las normas establecidas para las unidades porcinas de Ecuador.

Se utilizaron seis cerdas entre dos y cuatro partos, del cruce Landrace x Pietrain y a partir de la descendencia se conformaron tres grupos con 19 lechones (dos camadas por grupo, con tamaño de camada entre nueve y 11 lechones). El biopreparado de L plantarum 22 LMC se aplicó mezclado con el alimento y agua ad libitum.

Tratamiento 1 (T1): biopreparado de L. plantarum aplicado a los lechones en dosis de 5 mL x10⁹ UFC por animal, mediante una cánula por vía oral al momento del nacimiento, tercero y décimo cuarto día de edad (14 días). A partir de este momento el probiótico se aplicó una vez al día, mezclado en el alimento hasta el momento del destete (30 días promedio); los animales se identificaron con numeración en la oreja y de pesos homogéneos.

Tratamiento 2 (T2): se empleó este probiótico en dosis de 5 mL 1x10 ¹⁰ UFC/animal por vía oral en iguales condiciones descritas para el grupo 1.

Tratamiento 3 (T3) se aplicó placebo (medio de cultivo sin la presencia de L. plantarum 22 LMC), por igual vía, volumen y frecuencia de administración como los grupos anteriores. A partir del destete y hasta los 65 días de edad promedio (momento del sacrificio), el probiótico se aplicó diariamente según el grupo correspondiente:

T1: 20 mL x10⁹ UFC/kg de alimento

T2: 20 mL x10¹⁰ UFC/kg de alimento

T3: placebo

Los cerdos consumieron 0.031 kg día/animal hasta los 21 días de edad, a partir de los 30 días 0.350 kg día por animal hasta los 35 días y 0.790 kg día/ animal hasta los 65 días.

Los animales de los tres grupos se mantuvieron en iguales condiciones de manejo, tenencia y alimentación, los mismos se ubicaron en el interior de la nave en corrales independientes y adecuadamente separados para evitar el contacto.

La alimentación se realizó con un alimento balanceado para cerdos a partir de maíz, soya, harina de pescado, premezcla de vitaminas, aminoácidos (lisina y metionina), minerales (fosfato monocálcico) y cloruro de sodio. La composición bromatológica del concentrado consistió en materia seca 87.0%, grasa bruta 3.5%, fibra bruta 2.8% y cenizas 5.9% (Campagna 2009).

Se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos:

Indicadores bioproductivos

Se estimaron el peso al inicio y al final del experimento (65 días de edad), la conversión alimenticia y la ganancia media diaria; los animales se pesaron en una báscula esfera de reloj (Camry USA) de 50 kg.

Indicadores de salud

Se estimaron la prevalencia, el grado de afectación y la duración del síndrome diarreico (días), así como la mortalidad y la morbilidad desde el nacimiento hasta el momento del sacrificio.

Se realizó extracción de sangre a todos los lechones a partir del seno venoso oftálmico en dos momentos (al nacimiento y al final del experimento a los 65 días de edad). La sangre se colectó en tubos vacutainer® que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y tubos sin anticoagulante para la obtención de suero sanguíneo.

A partir de estas muestras se analizaron los indicadores hemáticos de la serie roja: eritrocitos, hematocrito, hemoglobina, VCM (volumen corpuscular medio), HCM (Hemoglobina corpuscular media) y CHCM (Concentración de hemoglobina corpuscular media).

Los indicadores de la serie blanca fueron: leucocitos totales y diferencial sanguíneo. El conteo de plaquetas se realizó mediante un analizador hematológico HUMA COUNT 30TS (HUMAN, Alemania).

A las muestras de suero sanguíneo se determinaron: las proteínas totales, la albúmina y globulinas, mediante un analizador bioquímico MINDRAY BA-88 A (Gematec, Argentina).

Se realizó el estudio morfométrico e histológico del tracto gastrointestinal de tres animales por grupo seleccionados aleatoriamente. El sacrificio de los cerdos se realizó a los 65 días de edad, según Gemus-Benjamin (2015).

Los distintos segmentos del intestino delgado y grueso se separaron del mesenterio para tomar las muestras correspondientes. Para ello, se obtuvo la muestra del duodeno a una distancia de 5 cm del píloro, del yeyuno a la altura de la curvatura íleocecal y del íleo a 5 cm del ciego. Del intestino grueso se tomaron muestras del colon y ciego en fragmentos de igual tamaño que lo descrito para el intestino delgado. Las muestras de los distintos segmentos de intestino delgado se ubicaron en frascos de formol neutro tamponado a 10%, en un volumen diez veces superior al de la muestra. Las muestras se procesaron por la técnica clásica de inclusión y corte en bloques de parafina y teñidas con hematoxilina y eosina (Luna 1968). Las muestras de intestino grueso se envasaron en frascos estériles para realizar posteriormente el análisis microbiológico.

Para el estudio de las variables morfométricas de cada corte histológico se tomaron 15 vellosidades del duodeno, yeyuno e íleon de cada animal, correspondiente a cada tratamiento, según la metodología descrita por Marion (2002). El procesamiento se realizó a partir de las fotos tomadas en el microscopio óptico utilizando lente de 10 x mediante el software Am Scope 3.7 para cámara digital.

Se evaluaron las siguientes variables: Altura de la mucosa: a partir del punto medio situado en la base de la vellosidad se trazó una línea hasta el ápice de la misma. Ancho de la mucosa: a partir de una línea se unieron los bordes apicales de las células epiteliales de lados opuestos, ubicadas en la mitad de la vellosidad. Profundidad de las criptas intestinales: a partir de la base de la cripta hasta la transición cripta vellosidad. Se obtuvo el peso de hígado, bazo y timo, mediante una balanza digital (SARTORIUS, BL 1500) con precisión de 0.1 g. Posteriormente, se calculó el peso relativo de los órganos referidos con anterioridad.

Análisis microbiológico

Se extrajeron los contenidos cecales de las muestras de intestino grueso, se tomó un gramo del contenido cecal de tres animales por tratamiento. Las misma se homogenizaron en 9 mL de medio diluyente (Caldwell y Bryant 1966) y se realizaron diluciones decimales en agua de peptona (OXOID, EUA) hasta el valor10^-14.

Se realizaron las correspondientes siembras en los medios de cultivo específicos para cada tipo de microorganismo (anaerobios totales, levaduras, coliformes, y lactobacilos). La incubación se realizó a 37ºC durante 72 horas para el conteo de Lactobacillus spp, 24 horas para determinar coliformes totales, 48 horas para levaduras y 4 días para el conteo de anaerobios totales, según la técnica de Hungate (1966).

Medios de cultivo selectivos empleados: el conteo de levaduras se realizó en Agar Maltosa de Sabouraud + cloranfenicol 0,5 % (BioCen Cuba), el conteo de anaerobios totales en NRF (Caldwell y Bryant 1966), modificado por Elías (1971). Para el conteo de coliformes totales se empleó Agar Bilis Rojo Violeta (OXOID EUA), y para el conteo de Lactobacillus spp Agar MRS Lactobacilli (Difco^TM EUA).

Todos los protocolos experimentales se aprobaron por el Comité de Ética del CENSA y UTM.

Análisis estadístico

Para el análisis de los resultados se empleó el Software estadístico INFOSTAT versión 1 (Di Rienso et al 2016). Para el tratamiento estadístico de los datos se realizaron análisis de varianza según un diseño completamente aleatorizado; para verificar diferencias se utilizó la prueba de comparación de Duncan (1955).

Para la comparación de la presentación la diarrea y la mortalidad entre los diferentes grupos se utilizó el paquete COMPAPROP, sistema para comparación de proporciones múltiples según Castillo y Miranda (2014). En el análisis de los recuentos microbianos se emplearon pruebas no paramétricas.

Resultados y discusión

Los grupos tratados con el probiótico a base de L. plantarum mostraron un mejor comportamiento en los indicadores bioproductivos como el peso al final de experimento, la conversión alimentaria y la ganancia media diaria con respecto al grupo control (Tabla 1).

El consumo de probiótico constituido por Lactobacillus spp. asegura en el intestino una mejor absorción de nutrientes, por lo cual la capacidad digestiva es mucho más eficiente, lo que provoca un incremento de la disponibilidad proteica brindándole al organismo lo necesario para mejorar el rendimiento productivo de los cerdos (Tufarelli et al 2017; Dlamini et al 2017).

El análisis de los indicadores de salud mostró que, durante los 65 días de duración del experimento, solo tres animales del grupo control presentaron diarrea desde el día 15 al 22, en la etapa de lactancia.

El grado de afectación comenzó por diarreas pastosas los días 15, 16 y 17, a partir de este momento se observó diarreas liquidas y posteriormente, los tres animales murieron en los días 20, 21 y 22 respectivamente, lo que representa el 15. 78 % (3/19) de animales con síndrome diarreico y muertos durante el experimento.

En los grupos tratados con el probiótico no se observó la presencia de diarrea ni hubo mortalidad; la comparación entre los grupos tratados y el control mostró diferencias para la incidencia de diarrea y mortalidad.

Diferentes autores describen el efecto beneficioso de la aplicación de probióticos en la salud de la especie porcina, entre los que se señalan la disminución de los trastornos gastrointestinales (diarreas), con reducción de los costos de producción por concepto de disminución en la utilización de medicamentos y en el indicador de mortalidad (Dong et al 2014; Lu et al 2018).

Los resultados del presente estudio coinciden con lo referido por los autores citados previamente ya que las condiciones experimentales en las que se desarrollaron las investigaciones presentaron bajo desafío sanitario, debido a que los animales se criaron en instalaciones nuevas con correctas condiciones de manejo, tenencia, alimentación, así como desinfecciones previas como las sugiere Yang et al (2009).

Por tanto, el tiempo de aplicación, la eubiosis de la microbiota intestinal, la dosis, la calidad de preparación y la producción del probiótico, así como el manejo y confort de los animales, determinan en la acción del aditivo microbiano (Ayala 2014).

El efecto de la aplicación del biopreparado a base de L. plantarum sobre los indicadores hemáticos de la serie roja (Tabla 2), reveló diferencias (p ≤ 0.05) para el valor de hematocrito del grupo T1, con respecto al control, la comparación entre los grupos tratados T1 y T2 no mostró diferencia. El conteo de eritrocitos totales fue superior en los grupos T1 y T2 con respecto al control, mientras que los valores de hemoglobina no difieren entre grupos en estudio.

El análisis de los indicadores de la serie roja mostró valores de hematocrito, eritrocitos totales y de hemoglobina que se encuentran dentro de los límites fisiológicos descritos para la categoría zootécnica y especie porcina (Jackson y Cockcroft 2002).

La aplicación del probiótico propició indirectamente la hematopoyesis, esto se observa en el aumento del conteo de eritrocitos totales en los grupos tratados y en los valores de volumen corpuscular medio (VCM) y la concentración media de hemoglobina globular o celular (CMH) excepto este último en el grupo control, ligeramente inferior a 30.3 g/dL reportado como fisiológico por estos autores.

Resultados similares se reportan por diferentes autores; Meng et al (2010) y Lan et al (2016) afirmaron que al alimentar a los cerdos con una mezcla de probióticos, no influyó en los rangos sanguíneos.

El análisis del efecto de L. plantarum sobre los indicadores de bioquímica sanguínea (Tabla 3) no evidenció diferencias para los valores de proteínas totales plasmáticas y albúminas entre los diferentes grupos en estudio; sin embargo, los niveles medios de inmunoglobulinas fueron superiores en los grupos de animales tratados.

A partir de estos resultados se infiere el efecto positivo del probiótico sobre el sistema inmune, con una inducción de la respuesta inmune humoral, debido a la activación de las células mononucleares, linfocitos y citoquinas, aspecto que confirma su efecto inmunoestimulante (Ayala et al 2014).

Los indicadores morfométricos relacionados con el peso relativo de los órganos estudiados (hígado, bazo y timo); mostraron diferencias (p ≤ 0.05) en los grupos tratados con respecto al control (Tabla 4). Los probióticos poseen diversas funciones, entre las que se encuentra aumentar la actividad fisiológica del hígado relacionada con la hidrólisis de las sales biliares.

En cuanto al peso relativo del timo y bazo existieron diferencias (p≤ 0.05) con relación a los grupos tratados a favor del grupo T2. Estos órganos están relacionados con la respuesta inmune y tienen una marcada importancia durante la primera etapa de la vida de los animales (García et al 2018).

Al analizar el efecto de la aplicación del probiótico de L.plantarum sobre el desarrollo intestinal de los cerdos sacrificados a los 65 días de edad, se constató que los cerdos pertenecientes a los grupos tratados con el probiótico presentaron de manera general mejor comportamiento con respecto al grupo control o placebo. El efecto de la aplicación del probiótico de L.plantarum sobre el desarrollo del intestino delgado (duodeno, yeyuno, íleon) de los cerdos sacrificados reflejó mayor altura de la mucosa y de las vellosidades intestinales a favor de los grupos tratados con respecto al grupo control (Tabla 5). La evaluación de la profundidad de las criptas, demostró valores superiores al comparar el tratamiento T1 con el control en las tres porciones del intestino, no se comportó así para el tratamiento T2 en los que se alcanzaron los indicadores más bajos en los segmentos de yeyuno e íleon. En los grupos tratados se observó diferencias (p< 0.05) en cuanto a la altura de la mucosa, la altura y el grosor de las vellosidades y la profundidad de las criptas con respecto al grupo control, esto sugiere una mejor capacidad de adsorción de los nutrientes (Chiquieri et al 2010).

El consumo de probióticos se asocia a mejoras del desarrollo del intestino (Franz et al 2011), debido a que favorecen el crecimiento de las vellosidades intestinales y, a su vez, aumentan la actividad enzimática, el transporte y la absorción de nutrientes en el epitelio intestinal (Giang et al 2010; Jurado et al 2011).

Con relación al comportamiento de los indicadores microbiológicos posterior a la aplicación de L. plantarum 22 LMC (Tabla 6), se corroboró su efecto probiótico al observar un aumento de la presencia de Lactobacillus ssp en la población microbiana cecal al momento del sacrificio, con una disminución de la concentración de coliformes totales y anaerobios totales, con respecto al grupo control. En cuanto al crecimiento de levaduras no fue significativo para los tratamientos evaluados.

Estos resultados son indicativos de la colonización del tracto gastrointestinal de los cerdos en estudio a partir de la ingestión del probiótico. Muchas bacterias probióticas, especialmente bacteria ácido lácticas, fermentan carbohidratos como lactosa para producir ácidos grasos de cadenas cortas, tales como ácido láctico y ácido acético, lo que disminuye el pH luminal a un nivel en que las bacterias dañinas no se pueden desarrollar (Bajagai et al 2016).

Algunas especies también producen peróxido de hidrógeno, que inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas (Yirga 2015; Bajagai et al 2016), causantes de trastornos gastrointestinales.

Estos resultados están en correspondencia con Krause et al (2010) quienes describieron que existe una relación inversa entre la presencia de bacterias probióticas en diferentes segmentos del intestino y la presencia de bacterias patógenas con una tendencia a la reducción de las diarreas en los cerdos en estudio.

Uno de los mecanismos que explican el efecto beneficioso de los probióticos, a partir de la capacidad de los mismos para proteger contra los desafíos infecciosos o patológicos, se fundamenta en los criterios de Martins et al (2012), quienes exponen que los probióticos pueden minimizar la proliferación de agentes patógenos al competir por los nutrientes y sitios de adhesión en las paredes intestinales.

Los cultivos de Lactobacillus spp pueden eliminar las bacterias dañinas, debido a los efectos que causan en el tracto gastrointestinal como son: el descenso de pH, la formación de agregados con otras bacterias que son eliminadas, que compiten por las proteínas y otros alimentos, además de la producción de bacteriocinas (Chiang et al 2015).

Conclusiones

Los resultados del presente estudio demuestran que la adición de cultivos de L. plantarum 22 LMC en la dieta de lechones ejerce una respuesta tipo probiótica al influir de manera positiva en indicadores de salud, aumento de las vellosidades intestinales con menor profundidad de las criptas, que influyó en una mejor absorción de los nutrientes, y en el comportamiento bioproductivos de los mismos.

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Received 12 March 2019; Accepted 29 October 2019; Published 2 November 2019

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