Comparación de las técnicas in situ de los sacos de nylon e in vitro (Daisy^II) para estimar la cinética de degradación de alimentos para rumiantes

 A Ceballos, R R Noguera, D M Bolívar* y S L Posada

Universidad de Antioquia, Facultad de Ciencias Agrarias – Grupo de Investigación en Ciencias Agrarias GRICA
ricardonoguera@agronica.udea.edu.co

^*Universidad Nacional de Colombia  sede Medellín, Facultad de Ciencias Agropecuarias

Resumen 

Este trabajo tuvo por objetivo comparar las técnicas in situ de los sacos de nylon e in vitro (Daisy ^II) para estimar la cinética de degradación de alimentos para rumiantes y verificar si ellas son intercambiables entre sí. Para ello, las técnicas fueron comparadas a través de análisis de regresión y correlación, pruebas de intercambiabilidad de Bland-Altman y análisis de medidas repetidas en el tiempo.

El análisis estadístico de la información permitió concluir que las técnicas no son intercambiables entre sí para estimar la cinética de degradación del alimento. Sin embargo la técnica in vitro mostró predecir con razonable aproximación la degradación de la materia seca a las 96 horas de incubación, pudiendo ser utilizada como una técnica para determinar la extensión de la degradación.

Palabras clave: Bland-Altman, evaluación de alimentos, exactitud, degradación, rumiantes

Comparison of the nylon bag in situ technique and in vitro (Daisy^II) to estimate the kinetics of degradation of feeds for ruminants

Abstract 

This work had for objective to compare the in situ nylon bag technique and in vitro (Daisy ^II) to estimate the degradation kinetics of foods for ruminant and to verify if the two techniques are interchangeable. For it, the techniques were compared through regression analysis and correlation, the Bland-Altman test and analysis of repeated measures in the time.

The statistical analysis of the information allowed concludes that the techniques are not interchangeable to estimate the degradation kinetics of the food. However, the in vitro technique predicted with accuracy the dry matter degradation to the 96 hours of incubation, being able to be used as a technique to determine the degradation extension.

Key words: accuracy, Bland-Altman, degradation, food evaluation, ruminants

Introducción

Los sistemas de evaluación de alimentos requieren datos precisos que permitan ser utilizados en la formulación de raciones para rumiantes. Entre la información más pertinente se encuentran las  estimativas de consumo voluntario, digestibilidad, y valor nutricional de las diferentes fuentes forrajeras, lo cual se reflejará particularmente en el desempeño animal.

En el  trópico colombiano se encuentra gran disponibilidad de recursos alimenticios, no sólo  de materias primas para formular raciones, sino también de forrajes de los cuales en muchos casos se desconoce su composición, digestibilidad, dinámica digestiva, presencia de factores antinutricionales, entre otros.  Técnicas in situ que usan sacos de nylon  e in vitro que simulan el ambiente ruminal son ampliamente utilizadas en nuestro medio para caracterizar la digestibilidad y la cinética de degradación de recursos forrajeros principalmente.

La desaparición de la materia seca (MS) por la incubación del alimento en el rumen a través de la técnica in situ permite evaluar alimentos para rumiantes en cuanto a su potencial de degradación. Esta metodología es simple y no requiere complicadas técnicas de laboratorio para alcanzar este objetivo. Sin embargo, esta técnica presenta  limitaciones serias, al ser una técnica altamente invasiva, lo que puede afectar directamente el consumo de alimento por parte del animal, no permite evaluar alimentos con altos contenidos de material soluble, pequeño tamaño de partícula o con alto contenido de almidones y lípidos, una vez que este material puede escapar de las bolsas sin ser degradado.

El sistema Daisy^II (ANKOM Corp., Fairtport, NY, EEUU) se utiliza como método alternativo para calcular la degradación del alimento en el rumen en condiciones de laboratorio. Este sistema permite simplificar el proceso de medición  de la degradación del alimento y consiste en una cámara aislada con temperatura controlada (39°C) y cuatro jarras independientes que giran permanentemente durante el proceso. Cada jarra permite la incubación de 25  muestras que están en contacto con una solución tampón y líquido ruminal. Las muestras son incubadas en bolsas de poliéster/ polietileno y se asume que el material que desaparece de la bolsa es digerido. Diferentes autores reportan que las predicciones de digestibilidad aparente y verdadera realizadas por este sistema son relativamente precisas  (Julier et al 1999; Vogel et al 1999). Por otra parte, Mould y Nordheim (1998) adaptaron esta técnica para estimar además la tasa de degradación de la materia seca y otras fracciones de los alimentos, retirando bolsas de los frascos a diferentes tiempos de incubación. Esta modificación ha sido adoptada con éxito para evaluar el efecto de aditivos enzimáticos en alfalfa (Colombatto 2000).

El objetivo de este trabajo fue comparar las técnicas in situ de los sacos de nylon e in vitro Daisy^II para estimar la cinética de degradación de recursos forrajeros para rumiantes y verificar si las dos técnicas son intercambiables entre sí.

Materiales y métodos 

Forrajes

Fueron utilizadas tres gramíneas, sorgo forrajero (Shorgum sp), elefante (Pennisetum purpureum), con 60 días de rebrote y maralfalfa (Pennisetum violaceum), con 45 días de rebrote. Los forrajes fueron cosechados en la Hacienda el Progreso, propiedad de la Universidad de Antioquia, ubicada en el Municipio de Barbosa (Antioquia). La Hacienda se encuentra a una altura de 1300 m.s.n.m, con una temperatura promedio de 22º C y una precipitación anual de 1656 mm. 

Las gramíneas mencionadas fueron utilizadas para comparar dos técnicas de digestibilidad (técnica de las bolsas de nylon, y  técnica in vitro Daisy^II). Una vez colectadas todas las muestras de forraje se picaron  en partículas con tamaño medio de 2 cm, empleandose una picadora estacionaria Nogueira modelo DPM –4. El material picado, fue individualmente homogenizado y secado en estufa de ventilación forzada a una temperatura de 65^o C por 72 horas. Las muestras secas fueron molidas usando un molino de laboratorio Thomas – Willey modelo No. 4, a través de una criba de1 mm para las incubaciones in vitro  y a través de una criba de 2 mm para la técnica in situ de las bolsas de nylon.

Técnica in situ

Fueron utilizadas tres vacas Holstein pertenecientes a la Hacienda Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia (sede Medellín) con cánula ruminal permanente de 10 cm. de diámetro interno, para determinar la degradación de la materia seca través de la técnica In situ descrita por Ørskov and McDonald (1979). Los animales fueron  mantenidos en pastoreo libre consumiendo pasto kikuyo (Pennisetum Clandestinum), sal mineralizada y agua  ad libitum.

Se emplearon sacos de nylon de 10 cm. de ancho x 15 cm de largo y con un tamaño de poro de 50 μm de diámetro. Seis gramos de muestra se pesaron y fueron adicionados dentro de cada saco, que posteriormente fue sometido a incubación ruminal en cada una de las tres vacas en los horarios 6, 12, 24, 48, 72 y 96 horas. En los horarios  0 y 6 horas, las muestras de forraje fueron incubadas en forma individual, en tanto que en los horarios 12, 24, 48, 72 y 96 las muestras fueron incubadas en duplicado. Las incubaciones comenzaron temprano en la mañana y se hicieron sucesivas  de acuerdo a los tiempos programados de permanencia en rumen, y para facilitar el retiro de todos los sacos al final del tiempo de incubación 96 horas. Después de haber retirado los sacos estos fueron lavados manualmente con agua corriente hasta que escurrió limpia.

Los sacos fueron colocados  en bandejas de aluminio y secados en estufa de ventilación forzada a 65^o C por 72 horas. Después de este tiempo, fueron transferidos para desecador por un periodo de 30 minutos y se pesaron. La diferencia entre el peso inicial de la muestra colocada en los sacos y el peso del residuo después de la incubación, descontándose el peso del saco vacío, fue utilizada para determinar el desaparecimiento de la MS en el rumen. (Ørskov and McDonald 1979).

Las curvas de degradación fueron ajustadas asumiendo que la desaparición de la MS de los sacos de nylon en el tiempo sigue un proceso cinético de primer orden, descrito por la ecuación:

P (t) = a + b (1- exp (-c *t))

Donde:  

P es la cantidad de alimento que desaparece del saco después de un tiempo t de permanencia en el rumen,

a es la fracción rápidamente degradable,
b es la fracción lentamente degradable,
c es la tasa de degradación (h^-1) de la fracción b (Ørskov and McDonald 1979).

Debido a que el tamaño de las jarras de incubación en la técnica in vitro limita el número de bolsas a incubar, solo cuatro horarios de la técnica in situ fueron utilizados para realizar las comparaciones entre técnicas. Estos horarios fueron: 6, 12, 48 y 96 horas.

Técnica de digestibilidad “In vitro”

Las muestras de forraje fueron incubadas in vitro de acuerdo con la metodología Daisy^II (ANKOM Corp, NY, EEUU 2008). Para la incubación in vitro, el día anterior se preparó el medio de cultivo de acuerdo con las recomendaciones de Mauricio et al (2001). El medio estuvo compuesto por una solución macromineral (9.35 g/l de Na₂HPO₄.12H₂O, 6.2 g/l de KH₂ PO₄  y 0.6 g/l de MgSO₄.7H₂O), una solución micromineral (132 g/l de CaCl₂.2H₂O, 100 g/l de MnCl₂.4H₂O, 10 g/l de CoCl₂.6H₂O y 80 g/l de FeCl₃.6H₂O), una solución tampón (4.0 g/l de NH₄HCO₃ y 35 g/l de NaHCO₃), indicador (0.01 g/l de rezasurina) y agente reductor (625 mg HCl cisteína, 95 ml de agua destilada, 4.0 ml de 1M NaOH y 625 mg de Na₂S.9H₂O). Estas soluciones se mezclaron en el siguiente orden y proporción: 500 ml de agua destilada, 200 ml de solución tampón, 200 ml de solución micromineral y 1 ml de solución indicadora. El medio fue saturado con CO₂ por dos horas hasta que tomó una leve tonalidad rosa y se almacenó en refrigerador para evitar su fermentación. Cinco horas antes de la inoculación, las jarras fueron removidas del refrigerador y llevadas a una estufa de ventilación forzada a 39º C. Una vez el medio alcanzó esta temperatura, se adicionó el líquido ruminal a cada jarra en una proporción de 4:1. (1600 ml de medio de cultivo y 400 ml de líquido ruminal). La solución fue vigorosamente agitada para permitir una mezcla uniforme, luego fue transferida para un extractor de gases y saturada continuamente con CO₂, hasta ser llevada al sistema Daisy^II para iniciar la incubación.

El incubador Daisy^II consta de  4 jarras, con 4 litros de capacidad cada una, que rotan permanentemente facilitando la agitación constante del material incubado y al interior del sistema se dispone de una temperatura controlada de 39 ºC (De Figueiredo et al 2000). Con la aplicación de este método, el material que desaparece de las bolsas durante la incubación es considerado digerible (Mabjeesh et al 2000).

Se utilizaron 3 jarras, para igualar el número de animales utilizados en la técnica in situ (cada jarra fue inoculada con el liquido ruminal correspondiente a cada uno de los tres animales usados en la técnica in situ)  y la cuarta jarra se llenó de agua para igualar el peso de los demás y permitir una buena rotación de estos al interior de la cámara.

Obtención y preparación del inóculo

El líquido ruminal fue retirado de las tres vacas utilizadas en el experimento in situ, el cual fue extraído manualmente de varias partes del rumen y almacenado en garrafas térmicas. Después de la colecta, el líquido ruminal fue filtrado a través de dos paños de algodón, la parte sólida retirada de los paños fue rápidamente transferida para una licuadora con cierta porción de líquido ruminal y licuado por 20 segundos. Después de este procedimiento el material licuado fue nuevamente filtrado y transferido para un erlenmeyer mantenido en baño maría a 39º C y continuamente saturado con CO₂. Este procedimiento se realizó para garantizar que el inóculo resultante estuviese compuesto por microorganismos ruminales adheridos y no adheridos a la fibra (Theodorou et al 1994).

Para la aplicación de esta técnica fueron utilizadas 36 bolsas de  poliéster/polietileno (3 forrajes x 4 horarios de degradación x 3 inóculos). Además en cada jarra de incubación fue incluida una bolsa vacía   con el fin de hacer las respectivas correcciones por  el  posible  ingreso  de  partículas  ó pérdida de peso de las bolsas durante el proceso de incubación. Las bolsas tenían un tamaño de poro de 25 µm y  dimensiones de 5 x 4 cm, en cada una de las cuales se depositaron 250 mg de muestra y fueron  selladas  con  calor.

Los  tres forrajes fueron incubados por 96 horas en cada una de las tres jarras. Para el estudio de la cinética de degradación, tres bolsitas de cada jarra fueron retiradas en los horarios 6, 12, 48 y 96 horas.   Las tres bolsas que correspondían a cada horario de incubación se introdujeron en una malla de nylon con tamaño de poro aproximadamente de 1 cm, para permitir el completo contacto de cada bolsa con el medio e  impedir la dispersión de las bolsas al interior de la jarra, las mallas eran de colores diferentes para facilitar su retiro en los mencionados tiempos de incubación.

Las curvas de degradación de la MS obtenidas a través de esta técnica fueron ajustadas con el mismo modelo descrito para estudiar la degradación de la MS en la técnica in situ.

Análisis estadístico

Las curvas de ajuste y las estimativas de los parámetros de interés biológico para las dos técnicas en estudio fueron realizadas a través del proceso iterativo del algoritmo Marquart con ayuda del procedimiento para modelos no lineales PROC NLIN de SAS (2003).

Para determinar sí el método in vitro Daisy^II puede reemplazar al método in situ de los sacos de nylon en su capacidad para describir la cinética de degradación,  fue utilizada la exactitud como parámetro de validación entre las técnicas. La  exactitud se determina por la comparación de los valores obtenidos en el método propuesto (in vitro) con los valores de referencia del método caracterizado (in situ) (Godden et al 2000). Para ello, la intercambiabilidad entre las dos técnicas fue analizada mediante el método de Bland-Altman  que determina la exactitud como parámetro de validación entre estas.  Este análisis incluyó la graficación de las medias pareadas (eje X) contra sus diferencias (eje Y). El cálculo de las medias pareadas corresponde al promedio de los valores observados entre las dos técnicas en cada horario de evaluación. En tanto que la diferencia se calcula restando de la técnica establecida como estándar, el valor obtenido con la técnica propuesta para cada horario de incubación. El intervalo de confianza alrededor de la media de las diferencias fue calculado (media de las diferencias ± 1.96 x desviación estándar de las diferencias) y sobrepuesto sobre el gráfico. El número de puntos que cayeron dentro del 95% del intervalo de confianza (o límite de concordancia) fueron registrados y posteriormente se efectuó análisis de regresión y correlación para las diferencias (Y) y los promedios (X) entre ambas técnicas (Altman y Bland 1983; Bland y Altman 1986).

Los valores de degradación de la materia seca para cada uno de los forrajes en estudio a través de los horarios de incubación, fueron comparados a través de un análisis de medidas repetidas en el tiempo utilizado el procedimiento PROC MIXED de SAS (2003).

Resultados y discusión  

Los parámetros de degradación estimados por el modelo propuesto por Orskov y McDonald (1979) son presentados en la tabla 1.  

Cuando comparados los valores de la fracción rápidamente degradable entre las dos técnicas, podemos observar que estos fueron siempre superiores en la técnica in situ, con valores que fluctuaron entre 14,35 y 28,06%, en tanto que para la técnica Daisy^II estos valores estuvieron entre 10,17 y 16,70%. 

Los mayores valores de la fracción a en la técnica in situ pueden ser atribuidos al tamaño de partícula empleado en este ensayo (2mm). El picado fino pudo favorecer el escape de las partículas en los primeros horarios de degradación. Nocek (1988), menciona que materiales finamente molidos sufren mayor perdida mecánica de partículas a partir de los sacos, sobrestimando la velocidad de degradación. Los movimientos ruminales pueden ser alrededor de 1440/día y estos ejercen una mayor presión mecánica sobre los sacos de nylon incubados e inducen una mayor pérdida de partículas, marcando una gran diferencia con respecto al sistema in vitro Daisy^II cuyos movimientos son solo rotativos sin ejercer más presión que el propio peso de las bolsas incubadas y de la solución utilizada para la incubación.

En la tabla 2, donde se presentan los porcentajes de degradación de la MS en el tiempo, puede observarse que el tiempo cero estimado mediante la inmersión de los sacos de nylon en el rumen por un periodo de 20 minutos, permitió la salida de un buen número de partículas con valores que fluctuaron entre 31,2 y 38,81%. 

En el caso de la fracción de lenta degradación b, los valores estimados a través de la técnica Daisy^II fueron superiores para los forrajes elefante y sorgo, cuando comparados con los estimados a través de la técnica in situ, con valores de 53,97% y 67, 49%, respectivamente. Por otro lado, para el pasto maralfalfa las estimativas hechas por las dos técnicas para esta fracción, fueron muy similares.

El modelo matemático propuesto por Orskov y McDonald (1979) establece una relación directa entre la tasa de degradación c y las fracciones a y b. Esta relación determina que cuando la fracción a aumenta y la fracción b disminuye en el alimento, las tasas de degradación estimadas tienden a aumentar. Esta relación queda claramente evidenciada en la tabla 1, donde para todos los casos los valores de las tasas de degradación estimados por la técnica in situ fueron siempre superiores a los valores estimados con la técnica in vitro Daisy^II. Es necesario considerar que las tasas de degradación no solo varían en función de la concentración de las fracciones a y b, también son función de la composición química de la fracción de lenta degradación, la presencia de material soluble en el alimento y la pérdida mecánica de partículas a partir de los sacos de nylon.   

La degradabilidad potencial (a+b) de los alimentos estimada después de 96 horas de incubación fue muy semejante entre las técnicas en estudio. La diferencia porcentual entre los valores estimados por la técnica Daisy^II e in situ, fue de 4,2, -5,04 y 3,9% para los forrajes elefante, maralfalfa y sorgo, respectivamente

En la tabla 2, son presentadas las comparaciones de los valores porcentuales de la degradación de la MS determinados por las dos técnicas en estudio. El análisis de medidas repetidas en el tiempo utilizando el procedimiento PROC MIXED de SAS, permite comparar tratamientos a tiempos específicos y de esta manera establecer la concordancia en las estimativas realizadas por cada una de las técnicas.

En el caso de los forrajes elefante y sorgo los valores de degradación de la MS estimados por las dos técnicas, en los horarios 6 y 12 horas son estadísticamente diferentes (p<0,01). En los horarios 48 y 96 horas la degradación de la MS fue estimada con buena aproximación por las dos técnicas para el pasto elefante (p>0,01), en tanto que para el sorgo las técnicas coincidieron en su estimación solo a las 96 horas de incubación (p>0,01). Para el pasto maralfalfa los porcentajes de degradación de la MS en los diferentes horarios estimados por las dos técnicas no concordaron en sus predicciones (p<0,01).

En todos los casos los valores degradación, estimados por la técnica in situ fueron siempre superiores a los observados en la técnicas in vitro. Esta discrepancia puede radicar en la salida de material soluble y  de partículas finamente molidas en la técnica in situ. Sin embargo, esta ventaja inicial va disminuyendo con el transcurrir del tiempo, de ahí que, a las 96 horas de incubación los valores de degradabilidad sean tan semejantes entre las dos técnicas (p>0,01).

Pérez (1997), manifiesta que los sistemas in vitro no replican perfectamente el proceso de digestión in vivo. La capacidad predictiva y la aplicabilidad de las técnicas in vitro varía dependiendo de la dieta del animal donador, manipulación del fluido ruminal, granulometría y peso de la muestra, volumen del fluido ruminal en relación con la solución tampón y del tiempo de fermentación.  

Para verificar si la técnica de digestibilidad in vitro Daisy^II puede remplazar con buena aproximación a la técnica in situ de los sacos de nylon en cuanto a su capacidad para describir la cinética de degradación en el rumen, un análisis estadístico de concordancia entre las técnicas fue realizado.

En la tabla 3, son presentados los coeficientes de correlación entre las técnicas en estudio en cada uno de los horarios de incubación. Puede observarse que en los horarios 6 y 12 horas la correlación entre los valores de degradación estimados es no significativa (p>0,01). Solo después de las 48 horas la correlación entre las dos técnicas es positiva y altamente significativa (p<0,01), esta situación indicaría que las técnicas se corresponden en sus estimativas sólo después de 48 horas de incubación.

La figura 1 muestra la regresión lineal entre los porcentajes de degradación de la MS en el tiempo, estimados a partir de las dos técnicas en estudio. Este análisis muestra una relación lineal significativa (p<0,01) con un razonable coeficiente de determinación (R²= 0,774). Esto indicaría que a partir de los valores observados en la técnica in vitro es posible predecir con cierta aproximación los valores in situ.

Dado que el análisis de regresión y correlación son medidas del grado de relación y no de concordancia (Posada 2007), la prueba de intercambiabilidad de Bland Altman fue utilizada. En ella, fue incluida la información de los tres sustratos en estudio cuyos resultados se observan en la figura 2 para la degradación de la MS  

En el caso de la degradación de la MS las diferencias fueron en su mayoría positivas a favor de la técnica in situ una vez que el 94,4% de los puntos están por encima del valor cero. Estas diferencias disminuyeron a medida que avanza el tiempo de incubación, de tal manera que estas se ubican en el límite inferior de la media después de las 12 horas de incubación.

En la prueba de intercambiabilidad de Bland-Altman, basada en el análisis de regresión para las diferencias (Y) y los promedios (X) entre ambas técnicas, el coeficiente de correlación de Spearman (r) de la degradación de la MS (-0,5438) y la pendiente de regresión (β) resultaron estadísticamente significativos (p<0,01). La significancia estadística del r y del β indica que la discrepancia entre la técnica in situ y la técnica in vitro no se mantuvo constante en todo el intervalo de la distribución, siendo mayores las diferencias en los primeros horarios de degradación y más estrechas a las 96 horas de incubación. Por tanto se puede concluir que las técnicas no son intercambiables y  que la técnica in vitro no permite hacer una adecuada estimativa de la cinética de degradación del alimento.

Conclusión 

• El análisis estadístico de la información permite concluir que las técnicas no son intercambiables entre sí para estimar la cinética de degradación del alimento. Sin embargo la técnica in vitro mostró predecir con razonable aproximación la degradación de la MS a las 96 horas de incubación, pudiendo ser utilizada como una técnica para determinar la extensión de la degradación.

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Received 29 March 2008; Accepted 29 May 2008; Published 3 July 2008

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