Efecto de la calidad morfológica del ovocito a la vitrificación sobre su capacidad de maduración y fecundación in vitro

J R Aké Villanueva, J R Aké López, E A Ordoñez León¹, N Y Aké Villanueva, J L Gerónimo Jiménez¹ y J C Segura Correa

Departamento de Reproducción Animal y Mejoramiento Genético, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Yucatán, Mérida, Yucatán, México.
armswp@hotmail.com
¹ Laboratorio de Fertilización In vitro“Brasuca S.A. de C.V.”. Villahermosa. Tabasco, México

Resumen

El objetivo fue evaluar el efecto de la calidad morfológica de los ovocitos bovinos a la vitrificación sobre su capacidad de maduración y fecundación in vitro. Se vitrificaron 509 ovocitos de diferente calidad (Grado 1=158; Grado 2=184; Grado 3=167), con Etilenglicol + DMSO en pajillas OPS. Inmediatamente después del calentamiento de los ovocitos, se procedió a la maduración in vitro (MIV), y fecundación in vitro (FIV). Para valorar la MIV y FIV una muestra de los ovocitos se fijaron después de la maduración y fecundación in vitro y se tiñeron con Lacmoid.

Los datos se analizaron mediante pruebas exactas de Fisher. El porcentaje de recuperación después de la vitrificación de los ovocitos, fue mayor en el grupo de ovocitos Grado 1 (100 %; P<0.05) en comparación con los ovocitos Grado 2 (95 %) y Grado 3 (92.2 %). La proporción de ovocitos maduros fue similar (P>0.05) entre los grupos y el promedio fue 23.7 %. El porcentaje de ovocitos fecundados también fue similar (P>0.05) entre los tres grupos (15.9 % en promedio). En conclusión, bajo las condiciones del presente estudio, la calidad de los ovocitos a la vitrificación no tuvo efecto sobre los porcentajes de maduración y de fecundación in vitro.

Palabras clave: bovinos, DMSO, Etilenglicol, FIV, trópico

Effect of morphological quality of the oocyte at vitrification on in vitro maturation and fertilization capacity

Abstract

The aim was to evaluate the effect of the morphological quality of bovine oocytes at vitrification on in vitro maturation and fertilization capacity. Five hundred and nine oocytes of different quality (Grade 1=158; Grade 2=184; Grade 3=167) were vitrified using Ethylene glycol + DMSO in OPS straws. Immediately post warming the oocytes were in vitro matured (IVM) and in vitro fertilized (IVF). To evaluate IVM and IVF, a sample of oocytes was fixed after maturation and after in vitro fertilization, and stained with Lacmoid. Data were analyzed using Fisher exact tests. The rate of oocyte recovery after vitrification was higher in the Grade 1 (100%; P<0.05) group compared to Grade 2 (95 %) and Grade 3 (92.2 %) oocytes. The proportion of mature oocytes was similar (P>0.05) between the groups and the overall average was 23.7%. The percentage of fertilized oocytes was also similar (P>0.05) among the three groups (15.9% on average). In conclusion, under the conditions of the present study, the quality of oocytes at vitrification had no effect on the rates of maturation and in vitro fertilization.

Key words: bovine, DMSO, Ethylene glycol, IVF, tropic

Introducción

La criopreservación de ovocitos y embriones puede ser una herramienta de gran utilidad en los programas de mejoramiento genético encaminados a mejorar la producción animal (Fernández-Reyez et al 2012). Así mismo, la crioconservación de ovocitos tiene importantes beneficios prácticos, económicos y éticos que pueden impactar positivamente la crianza animal, así como en los programas de reproducción asistida en humanos (Wang et al 2010; Galeati et al 2011). La crioconservación también es de gran valor para la conservación de material genético de hembras superiores o de especies amenazadas (bancos de germoplasma) y por facilitar estudios sobre aspectos de fisiología reproductiva y en la implementación de biotecnologías reproductivas (Galeati et al 2011; Fernández-Reyez et al 2012).

Sin embargo, los resultados de la crioconservación de ovocitos, no han tenido el éxito esperado y sigue siendo un desafío para la mayoría de las especies animales. Entre los factores limitantes se mencionan, el tamaño del ovocito, con una consecuente baja tasa de superficie/volumen, que perjudica la distribución de los crioprotectores a través de la membrana plasmática (Hyttel et al 2000), así como la gran sensibilidad del ovocito al enfriamiento (Díez et al 2012; Liang et al 2012).

Otros aspectos del ovocito que pueden influir en su viabilidad después de la crioconservación, son sus características morfológicas. Diversos estudios indican que la cobertura de células del cúmulus y la apariencia del citoplasma, pueden influir en la viabilidad de los ovocitos (Ambrosini et al 2006; Yadav et al 2008; Zhou et al 2010). En particular, se reporta que la presencia de múltiples capas células de cúmulus podría impedir que los crioprotectores logren distribuirse de manera uniforme en el interior del citoplasma, lo que ocasionaría que los ovocitos no resistan la crioconservación (Papis et al 2013). Por otra parte, se indica que vitrificar ovocitos sin células del cúmulus resultaría en daños que le impedirían realizar la maduración in vitro (Li et al 2006; Zhou et al 2010).

Diversos estudios muestran el efecto de la calidad del ovocito sobre su capacidad de maduración, fertilización y desarrollo embrionario in vitro (Santos et al 2008; Demyda-Peyrás et al 2013); sin embargo, son escasos los reportes que evalúan el efecto que tiene la vitrificación/calentamiento de ovocitos de diferente calidad morfológica sobre sus competencias de desarrollo.

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la vitrificación de ovocitos bovinos de diferente calidad morfológica sobre su capacidad de maduración y fecundación in vitro postcalentamiento

Materiales y métodos

Reactivos y medios.

Todos los reactivos utilizados en la preparación de los medios se obtuvieron de Sigma Chemical Co. (St Louis, MO, USA) a excepción que se indique lo contrario. El medio de maduración in vitro (MIV) consistió de TCM-199 (Gibco-BRL, NY, USA) suplementado con 0.2 mM de piruvato de sodio, 25 µM de bicarbonato de sodio, 0.5 µg/ml de FSH (Pluset, Hertape-Calier, Brazil), 100 UI/ml de HCG (Chorulon, Intervet, Holland) y 1.0 µg/ml de estradiol.

El medio de fecundación in vitro (FIV) fue Tyrode’s Albumina Lactato Piruvato (TALP), que consistió en 0.2 mM de piruvato de sodio, 3 mg/ml de BSA libre de acidos grasos, 25 mM de bicarbonato de sodio, 13 mM de lactato de sodio, 75 µg/ml de kanamicina, 4 µl/ml de solución PHE (2 mM de penicilamina, 1 mM de hipotaurina y 250 µM de epinefrina), y 10 µg/ml de heparina.

El medio de cultivo in vitro (CIV) consistió en fluido oviductal sintético (SOF) (Thompson et al 1995) suplementado con 0.2 mM de L-glutamina, 0.34 mM de citrato de sodio, 2.8 mM de mioinsitol, 2 % de solución MEM con aminoácidos esenciales, 0.2 mM de piruvato de sodio, 75 µg/ml de kanamicina, 5 mg/ml de BSA fracción V libre de ácidos grasos.

Recolección y selección de los ovocitos

Los ovocitos (n=509) utilizados en el presente estudio se recuperaron de ovarios de vacas obtenidos del rastro local de Mérida, Yucatán, México (21º 06ˊ N y 89º 27ˊ O). Los ovocitos fueron transportados desde el matadero hasta el laboratorio en un termo con solución salina (0.9 %) suplementada con kanamicina (0.007 g/l), en un lapso no mayor de 2 horas. En el laboratorio, los ovarios se lavaron dos veces con solución salina (37 ºC) y posteriormente se depositaron en un recipiente con solución salina fosfatada de Dulbecco (PBSD). La obtención de los ovocitos se realizó mediante punción/aspiración de los folículos antrales de 2 a 8 mm de diámetro (Zhou et al 2010) con una jeringa de 20 mL (Air tite) y una aguja calibre 18. El líquido folicular extraído se colocó en tubos Falco de 50 ml y se dejó sedimentar durante 15 min a baño María (a 37 ºC). Transcurrido este tiempo se eliminó el sobrenadante y el sedimento resultante se resuspendió en 10 mL de PBSD (37 ^oC). Posteriormente, el contenido del tubo se depositó en cajas de Petri (90 x 14 mm) en las cuales se procedió a la identificación y selección de los ovocitos con la ayuda de un estereomicroscopio equipado con una placa térmica a 38.5 ºC.

Tratamientos

Se formaron tres grupos de ovocitos de acuerdo al número de capas de las células del cúmulus y de la apariencia del citoplasma de acuerdo a lo descrito por Santos et al (2008), quedando de la siguiente manera:

Grado 1 : Ovocitos (n=158) con capas compactas de células del cúmulus, haciendo difícil evaluar su número, pero mayor de 8 capas, teniendo un ooplasma homogéneo de color uniforme.

Grado 2: Ovocitos (n= 184) con 5 ó más capas (pero menor a 8) de células del cúmulus, fácilmente identificables bajo el estereoscopio. En algunas partes del cúmulus puede haber menos de 5 capas, con ooplasma homogéneo de color uniforme.

Grado 3: ovocitos (n=167) con 3 capas o menos de células del cúmulus. En algunas partes del ovocito puede haber falta de la cobertura del cúmulus, y el ooplasma puede presentar pequeñas imperfecciones o un color irregular y con presencia de granulaciones en el citoplasma

Grupo control: Para control del proceso maduración y fecundación in vitro,, se utilizó un grupo de ovocitos (n = 100) de grado 1 y 2, los cuales no fueron sometidos al proceso de vitrificación.

Vitrificación y calentamiento de los ovocitos

Para la vitrificación, los ovocitos se lavaron 2 veces en medio TL-HEPES y posteriormente se equilibraron por 3 min en el primer medio de vitrificación (TL-HEPES + 7.5 % de dimetilsulfoxido + 7.5 % de etilenglicol) y seguidamente se expusieron al segundo medio de vitrificación (TL-HEPES + 16 % dimetilsulfoxido + 16 % etilenglicol + 0.4 M de sacarosa) por menos de un minuto. Durante este último proceso los ovocitos (5-6 ovocitos por pajilla) se cargaron por capilaridad en el extremo del borde abierto adelgazado de una pajilla (OPS; Minitüb), e inmediatamente las pajillas se sumergieron en forma horizontal en nitrógeno líquido. Las pajillas con los ovocitos se almacenaron en los termos contenedores de nitrógeno líquido hasta su descongelación.

Para el calentamiento (descongelación), las pajillas que contenían a los ovocitos se sacaron del termo de nitrógeno y se sumergieron (específicamente la punta de las pajillas, en donde se encontraban los ovocitos) en una solución de TL HEPES + 10 % de suero fetal bovino (FCS) + 0.13 M de sacarosa por 5 minutos. Inmediatamente, se evaluaron morfológicamente y se consideró que los ovocitos fueron no viables cuando: tenían perdida de la capa de células del cúmulus característica de su clasificación o bien presentaban daños evidentes en la zona pelúcida (roturas) o en citoplasma (picnosis y/o granulaciones) (Yadav et al 2008; Purohit et al 2012). Posterior a esta evaluación, los ovocitos viables se sometieron a su maduración.

Maduración de los ovocitos

Los ovocitos viables de cada grupo se lavaron tres veces en medio MIV, se colocaron en gotas (25-30 ovocitos por gota) de 100 µl de medio MIV, se cubrieron con aceite mineral y se incubaron por 24 h a una temperatura de 38.5 ºC, una atmosfera de 5 % de CO₂ y humedad a saturación.

Al finalizar la maduración, un grupo de ovocitos de cada tratamiento (Grado 1 = 52; Grado 2 = 51; Grado 3 = 61; Control = 44) se fijaron y se tiñeron para evaluar la tasa de maduración. Los ovocitos seleccionados se lavaron en PBSD y se situaron en microgotas del mismo medio en un portaobjetos (1 ovocito/microgota; 10 ovocitos por portaobjeto), en el cual, previamente se colocaron dos líneas paralelas de vaselina, y se cubrieron con cubreobjetos presionando hasta contactar con las microgotas. Los ovocitos se fijaron en 25 % (v:v) de ácido acético en etanol, a temperatura ambiente (24-26 ºC). Transcurrido el tiempo de fijación (48-72 h) los ovocitos se tiñeron con 1 % de Lacmoid en 45 % (v:v) de ácido acético en agua purificada y se examinaron en un microscopio de contraste de fases. Se consideró como ovocito maduro, cuando se observó la presencia de los cromosomas en Metafase II (MII) y la extrusión del cuerpo polar (Gil et al 2003).

Fecundación in vitro

Después de la maduración, los ovocitos se lavaron tres veces en medio de fecundación, y se colocaron en gotas de 90 µl de este medio (25-30 ovocitos por gota), se cubrieron con aceite mineral y se colocaron en la incubadora (± 15 min), en espera de la adición de los espermatozoides. A cada gota de FIV, se agregaron los espermatozoides en 10 µl del medio y se procedió a la incubación durante 24 h, a una temperatura de 38.5 ºC, una atmosfera de 5 % de CO₂ y humedad a saturación. Los espermatozoides se obtuvieron de semen congelado (pajillas) de un toro que previamente fue probado para la FIV. El semen descongelado se colocó en un tubo Falco (de 15 mL) conteniendo 4 mL de medio fecundación y se centrifugó durante 5 min a 500 rpm. Después de la centrifugación se retiró el sobrenadante, se colocaron nuevamente en 4 mL del mismo medio y se centrifugó otra vez durante 5 min a 500 rpm. El pellet de espermatozoides se retiró del fondo del tubo y se diluyó con medio TL en un microvial, se determinó la concentración y se ajustó a 1x10⁶ espermatozoides en 1 mL de medio.

Al finalizar la fecundación, un grupo de ovocitos de cada tratamiento (Grado 1 = 62; Grado 2 = 75; Grado 3 = 79; Control = 53) se fijaron en 25 % (v:v) de ácido acético en etanol, a temperatura ambiente. Transcurrido el tiempo de fijación (48-72 h) los ovocitos se tiñeron con 1 % de Lacmoid en 45 % (v:v) de ácido acético en agua purificada, y se examinaron en un microscopio de contraste de fases. Se consideró como ovocito fecundado, cuando se observaron los dos corpúsculos polares (en el espacio perivitelino), el pronúcleo femenino y el pronúcleo masculino, o la cabeza espermática descondensada con su correspondiente flagelo (Maside et al 2011).

Análisis estadístico

Diferencias entre las proporciones de ovocitos recuperados, viables, maduros y fecundados, por pares de los grupos evaluados (tratamientos) se determinó, mediante pruebas exactas de Fisher.

Resultados

Se vitrificaron un total de 509 ovocitos y a la descongelación se recuperaron 487, lo que representó 4.3 % de pérdida de ovocitos al calentamiento (descongelación) (Tabla 1). En el grupo de ovocitos Grado1 se recuperó el 100 % de ovocitos. En los tres grupos de ovocitos la viabilidad morfológica fue alta y no se encontró diferencia significativa (P > 0.05). El promedio general de ovocitos viables fue 97.5 % (Tabla 1).

No se encontró efecto de la calidad de los ovocitos vitrificados (P >0.05), sobre la proporción de ovocitos maduros, siendo el valor general 23.7 %. Así mismo, se observó que el porcentaje de maduración in vitro fue mejor en el grupo control en comparación con los tres grupos de calidad sometidos al proceso de vitrificación (Tabla 2).

Tampoco se encontró efecto significativo (P>0.05) para la fecundación in vitro entre las diferentes calidades de los ovocitos. El promedio de los ovocitos vitrificados fue 15.9 % en comparación con el grupo control, 81.1 % (Tabla 3).

Discusión

En el presente trabajo, al descongelar (calentamiento) los ovocitos, se encontró una alta tasa de recuperación (95.7 %), y al evaluarlos, la mayoría se encontraban morfológicamente viables (97.5 %). Estos resultados son similares a los encontrados por Purohit et al (2012), quienes vitrificaron ovocitos de cabras y encontraron altos porcentajes de ovocitos morfológicamente normales al calentamiento (93.0%); sin embargo, los porcentajes de recuperación fueron ligeramente inferiores (86.3%). Los aspectos antes mencionados son de gran importancia para el proceso de vitrificación, ya que por una parte, dan una idea de la eficiencia de este proceso y pueden ayudar a estimar las pérdidas de ovocitos ligadas a la crioconservación. Por otro lado, en cuanto a la viabilidad, también permiten estimar el grado de afectación de los ovocitos por el proceso de vitrificación.

Por otro lado, la calidad del ovocito a la vitrificación no presentó efecto sobre los porcentajes de maduración in vitro (23.7 %, en promedio) y son similares a los promedios reportados por Cetin y Bastan (2006) quienes después de la vitrificación de ovocitos bovinos, obtuvieron 20.7 % de maduración. Otros trabajos de vitrificación también reportan bajos porcentajes de maduración; por ejemplo, Albarracín et al (2005) reportan 9.9 % de maduración cuando vitrificaron ovocitos bovinos en estadio GVBD. Por su parte, Wani et al (2004) vitrificaron ovocitos de búfalos y después de la descongelación los sometieron a maduración, encontrando 27 % de ovocitos en MII; resultado ligeramente superior al hallado en el presente trabajo. Otro estudio realizado con ovocitos de cabras, reportan después de la vitrificación, porcentajes de entre 24 % y 31 % de ovocitos en MII (Bogliolo et al 2007). La falta de diferencia en las tasas de maduración in vitro en los diferentes grupos aquí evaluados, indica que, la calidad del ovocito a la vitrificación puede no ser un factor determinante de su capacidad para lograr la maduración in vitro, y que otros factores como el crioprotector y el estadio de desarrollo pudieran ser de mayor importancia (Albarracín et al 2005; Zarate-Guevara et al 2007). Sin embargo, es evidente que la vitrificación si afecta o reduce la capacidad de desarrollo de los ovocitos. Esto se puede apreciar en las bajas tasas de maduración encontradas en el presente trabajo en comparación con el porcentaje de maduración del grupo control (79.5 %); lo cual coincide con los bajos porcentajes de maduración notificados en la literatura (Albarracín et al 2005; Bogliolo et al 2007; Prentice et al 2011; Purohit et al 2012).

En el presente trabajo, tampoco se encontró efecto de la calidad del ovocito a la vitrificación sobre los porcentajes de fecundación in vitro y comparados con el grupo control fueron bajos (81.1 % vs 15.9 %). Los porcentajes de fecundación del presente estudio también son bajos comparado con lo reportado por Asada et al (2002), quienes mencionan en la especie bovina, porcentajes de penetración elevados (53 a 84.1 %) después de la vitrificación-calentamiento de los ovocitos. Purohit et al (2012) reportan que la tasa de fertilización de ovocitos de cabras es 25 % para ovocitos desnudos y 31.7 % para ovocitos cubiertos por las células del cúmulus. Por su parte, Yadav et al (2002) reportan 21.9 % de fertilización en ovocitos de búfalos, valores mayores a los encontrados en este trabajo. Asimismo, similar a lo encontrado para las tasas de maduración, los porcentajes de fertilización fueron para todos los casos, menores en los ovocitos vitrificados comparados con sus respectivos grupos control (Asada et al 2002; Yadav et al 2002; Purohit et al 2012).

Los bajos porcentajes de fecundación in vitro encontrados en el presente estudio, pueden ser debidos en forma importante a los bajos porcentajes de maduración que se tuvieron. Diversos estudios han demostrado la importancia de la maduración del ovocito sobre su capacidad para ser fecundado (Gilchrist y Thompson 2007; Fernández et al 2009; Demyda-Peyrás et al 2013), Asimismo, diversos investigadores reportan que la vitrificación ocasiona daños por exocitosis prematura de gránulos corticales lo cual está relacionado con bajas tasas de penetración (Díez et al 2012). También se reporta que el proceso de congelación y descongelación puede producir alteraciones en las propiedades fisicoquímicas de los lípidos intracelulares (Isachenko et al 2001; Kim et al 2001), alteraciones que pueden influir en la capacidad de desarrollo de los ovocitos. Además, el ovocito puede ser afectado por el crioprotector, ya que éstos pueden provocar toxicidad en los ovocitos (Fahy et al 1990).

Conclusión

• Bajo las condiciones el presente estudio no se encontró efecto de la calidad del ovocito a la vitrificación sobre la tasa de maduración y fertilización in vitro. Comparado con el grupo control, la vitrificación resultó en bajas tasas de maduración y fertilización in vitro.

Agradecimientos

Al CONACYT por la beca de Posgrado del primer autor; al Laboratorio Brasuca S.A. de C.V., en especial al Ing. Manuel Suárez Romero por todas las facilidades brindadas para la realización de este proyecto.

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Received 24 January 2018; Accepted 8 May 2018; Published 1 June 2018

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