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| Figura 1. Efecto del tiempo de incubación de melaza de
caña de maíz y melaza de caña de azúcar sobre la concentración de glucosa en licor ruminal |
| Livestock Research for Rural Development 28 (4) 2016 | Guide for preparation of papers | LRRD Newsletter | Citation of this paper |
Con la finalidad de determinar las tasas de hidrolisis de la urea y la sacarosa de las melazas de caña de azúcar (MCAz) y caña de maíz (MCMz) se realizaron dos experimentos. En el experimento 1, se evaluó la producción de glucosa en licor ruminal in vitro a partir de MCAz y MCMz así como los cambios en el pH. En el experimento 2, se estimaron los parámetros de la cinética de la hidrólisis de la urea en rumen in vitro.Los resultados muestran que no hubo interacción entre el tiempo de incubación y el tipo de melaza utilizada sobre el contenido de glucosa (p<0.24) y tampoco hubo interacción sobre el pH en el LR (p<0.61). La concentración de glucosa fue en promedio 3.9 veces más alta con la MCMz (199 mg/dL) que la encontrada con la MCAz (51.5 mg/dL) (p<0.01). En el experimento 2, la cinética de la hidrólisis de la urea en el LR fue prácticamente completada en los primeros 30 minutos de incubación presentando un parámetro b de cerca del 98% y una constante de hidrólisis de 21.2/h.
Palabras clave: cinética, glucosa, nitrógeno, rumen
Two experiments were done with the purpose of determining the rates of hydrolysis of urea and hydrolysis of sucrose from molasses of sugarcane and molasses from maize. In experiment 1, was evaluated the effect of adding maize molasses (MCMz) and sugar cane molasses (MCAz) on the contents of glucose, and pH in rumen liquor ( RL) in vitro. In experiment 2, were evaluated the effects on parameters of the kinetics of the hydrolysis of urea in rumen liquor (RL) in vitro. Four samples of 200 mL of RL were extracted from four Holstein cows, fitted with ruminal cannula. Rumen liquor was kept in anaerobic conditions and temperature of 38 ° C for both in vitro experiments. The results shown that was no interaction between the time of incubation and the type of molasses used on content of glucose (p < 0.24) and there was not interaction on the pH in the RL (p < 0.61). Glucose concentration was on average 3.9 times higher than with the MCMz (199 mg/dL) that found with MCAz (51.5 mg/dL) (p < 0.01). In experiment 2, the kinetics of the hydrolysis of urea in the RL was practically completed in the first 30 minutes of incubation, presenting a parameter b 98% and a constant of hydrolysis of 21.2/h.
Keywords: glucose, kinetics, nitrogen, rumen
La melaza de caña de azúcar (MCAz) y la urea se han utilizado en la suplementación de rumiantes debido a que se trata de fuentes de rápida disponibilidad de azúcares y nitrógeno no proteico para los microorganismos ruminales. Sin embargo, existen pocos estudios en los que se hayan caracterizado sus tasas de hidrolisis lo que ha llevado a que programas como el CNCPS tengan que asumir valores arbitrarios y hacer correcciones periódicas a las tasas de degradación (kd) de estas fracciones. Es así como en la versión 6.5 de este programa la kd del nitrógeno no proteico se asumió de 200 %/h corrigiendo el valor previo que era de 10.000%/h sin que dichos valores se basasen en estudios de cinética de degradación ruminal. En el caso de los azúcares, el modelo CNCPS se basa en solo dos estudios cuyos resultados son muy variables (Van Amburgh et al 2015) y con base en ellos asume que la kd puede variar entre 40 y 60%/h. En un trabajo previo, Weisbjerg et al (1998) habían estimado que la kd de la sacarosa podría oscilar entre 1200 y 1404%/h. La diferencia tan marcada para la kd para los azúcares entre estos autores, sugiere que aún faltan estudios que permitan establecer con mayor claridad este parámetro para los azúcares y los factores que lo modifican.
La rápida hidrolisis de la melaza de la caña de azúcar reduce significativamente el pH ruminal generando efectos negativos sobre la actividad microbiana y la salud de animal (Murray 2010). Otra fuente de azúcares que ha sido estudiada y utilizada en la alimentación de rumiantes es la remolacha azucarera (Vyhmeister et al 1982). También los residuos del cultivo de maíz han sido evaluados fundamentalmente por su contenido de fibra (Manterola et al 1999). Sin embargo, dichos residuos pueden presentar contenidos significativos de azúcares hasta el punto en que su rendimiento en miel puede superar las 5.0 toneladas anuales/ha (Correa 2013). La melaza de la caña de maíz (MCMz) ha sido muy poco evaluada como una fuente de azúcares para rumiantes por lo que existe muy poca información acerca del efecto de esta fuente sobre el contenido de glucosa y pH en el rumen. Existe un estudio de Correa et al (2013) en donde se concluyó que la MCMz produce mayores niveles de glucosa y reduce el pH de una forma más pronunciada que la MCAz. La concentración de glucosa en el rumen no es frecuentemente medida debido a que se presume que esta se hidroliza rápida y totalmente en el rumen (Oba, 2011) y que, por lo tanto, no hay necesidad de medirla. Otros trabajos, sin embargo, indican que la concentración de glucosa en el rumen puede alcanzar valores que superan incluso, la de la sangre (Elsden 1945; Horn et al 1979; Mohamed 2006).
La urea a su vez, es rápidamente hidrolizada a amoniaco en el rumen, siendo parcialmente responsable de la baja eficiencia de la captura de nitrógeno en el rumen por bacterias ruminales (Calsamiglia et al 2010). Este exceso de amoniaco va en detrimento de los animales (Bartley et al 1981) y puede contribuir a la contaminación ambiental (Broderick et al 2009). La combinación de urea con fuentes de carbohidratos solubles también ha sido reconocido como un factor importante en la utilización de amoniaco por el rumen y los microorganismos ruminales (Hristov y Ropp 2003).
Se pretende conocer al final cuales son los parámetros de hidrolisis de urea e hidrolisis de melazas observando las variaciones que se presenten a nivel ruminal entendiendo mejor su comportamiento como fuentes de energía y proteína de alta disponibilidad en rumen.
El trabajo de campo se llevó a cabo en el Centro de Producción Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, localizado en el corregimiento de Santa Elena (Antioquia), a 2300 m.s.n.m., con una temperatura promedio de 16°C, perteneciente a una zona ecológica de bh-MB (Espinal 1992).
De cuatro vacas Holstein dotadas con cánula ruminal y pastoreando praderas de Kikuyo (Pennisetum clandestinum) maduro de 70-80 días, se tomaron cuatro muestras de 200 mL de licor ruminal (LR) que se mantuvieron en condiciones anaeróbicas, a una temperatura promedio de 38ºC. Se usó melaza de caña de azúcar (MCAz) y melaza de caña de maíz (MCMz) estandarizadas a 74º Brix diluyendo 2.5 g de MCAz y MCMz en 5 mL de agua destilada quedando a una concentración de 500 mg/mL para cada fuente. La urea se diluyó usando 10 mg de urea en 10 mL de agua quedando a una concentración de 100 mg/dL.
La determinación de azucares totales y de cenizas en las muestras de MCMz y MCAz, se realizaron por los métodos descritos por la (AOAC 2005). La determinación de los grados Brix de estas dos fuentes se determinó por medio de un refractómetro portátil marca EXTECH RHF-30ATC.
En cuatro tubos de ensayo con 2 mL de licor ruminal (LR) (cada uno proveniente de una vaca diferente) se incubaron 50 mg/mL de MCMz y en otros cuatro se incubaron 50 mg/mL MCAz (con una concentración de 500 mg/mL). Simultáneamente se incubaron otros cuatro tubos de LR sin adición de ningún sustrato que se mantuvieron como controles (Ctrl). Estos fueron mantenidos en condiciones anaerobias a 38oC y a los 0, 15, 30, 60, 120 y 240 minutos luego de la incubación, se hizo la lectura de la concentración de glucosa mediante el kit enzimático No. 11503 de Biosystems® (Barcelona) haciendo las lecturas de absorbancia a 500 nm en un espectrofotómetro GENESYS™ 10S UV VIS. Simultáneamente se leyó el pH mediante un potenciómetro SCHOTT ® LAB 860.
En cuatro tubos de ensayo con 2 mL de LR (cada uno proveniente de una vaca diferente), se adicionaron 0.1 mL de urea (con una concentración de 100 mg/dL). Estos fueron mantenidos en condiciones anaerobias a 38oC y a los 5, 20, 40, 60, 90,150 y 240 minutos se determinó la concentración de urea y amoníaco mediante el kit enzimático No. 11536 de Biosystems® (Barcelona) haciendo las lecturas de absorbancia a 600 nm en un espectrofotómetro GENESYS™ 10S UV VIS. Simultáneamente se leyó el pH mediante un potenciómetro SCHOTT ® LAB 860.
Para el primer experimento se utilizó un arreglo factorial con medidas repetidas con cuatro repeticiones por tratamiento. El modelo estadístico planteado fue:
Yijk: µ + Mi + V(M)ij + Pk + PxM + εijk
Dónde:
Yijk= Variable respuesta
µ= Media general
Mi= Efecto de la i-esima fuente de melaza
V (M) ij = error asociado a la j-èsima vaca anidad en el i-ésimo tratamiento
Pk = efecto del k-èsimo periodo de evaluación
PxM = efecto de la interacción entre el periodo y la fuente de melaza
Εijk = Error aleatorio con media 0 y varianza σ2
Para ello se utilizó el PROC MIXED de SAS® (SAS 2001)
Para el segundo experimento se estimaron los parámetros de la cinética de hidrólisis de la urea se utilizando el modelo lineal de Ørskov y McDonald (1979):
Y = A + B (1 – e(-kd*t)
Dónde:
Y= hidrólisis de la urea en el tiempo t
A= Fracción soluble
B= Fracción potencialmente hidrolizable
kd= Tasa de hidrólisis de la fracción potencialmente hidrolizable
Para ello se utilizó el programa RUMENAL (Correa 2004).
La composición química de la MCMz y de la MCAz se presenta en la Tabla 1. Como se puede apreciar, la MCMz presentó valores más altos de azúcares totales y Grados Brix comparado con la MCAz, mientras que el contenido de cenizas, por el contrario, fue más alto en la MCAz. Son pocos los trabajos en los que se ha caracterizado la MCMz. Correa (2013) estimó la producción y composición química de la MCMz producida en Antioquia a partir de una variedad criolla y encontró que el contenido de azúcares totales y Grados Brix se incrementó con la edad de cosecha, al tiempo que se redujo el contenido de cenizas debido a la translocación de nutrientes hacia los granos en formación (Daynard et al 1969). En el caso de la caña de azúcar, el proceso es diferente al no existir granos que exijan la translocación de nutrientes. Así, Kung y Stanley (1982) reportaron un aumento en el contenido de extracto libre de nitrógeno en la caña de azúcar hasta los 15 meses, mientras que el de cenizas no se modificó. OGTR (2004) por su parte, indica que en promedio la MCAz presenta entre 48 y 58% de azúcares totales y entre 10 y 15% de cenizas totales; valores entre los que se encuentran los hallados en este trabajo para la muestra de MCAz utilizada.
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Tabla 1. Composición química de la melaza de la caña de maíz y de azúcar. |
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Melaza caña |
Melaza caña |
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Azúcares totales, % |
66.8 |
48.0 |
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Cenizas, % |
3.54 |
12.0 |
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Grados Brix |
88.8 |
79.5 |
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Azucares Totales. (74ºBrix), % |
55.5 |
44.6 |
La Figura 1 muestra que no hubo interacción entre el tiempo de incubación y el tipo de miel utilizada sobre el contenido de glucosa (p<0.237) mientras que la Figura 2, muestra que tampoco hubo interacción sobre el pH en el licor ruminal (p<0,614). La concentración de glucosa fue en promedio 3.9 veces más alta con la MCMz (199 mg/dL) que la encontrada con la MCAz (51.5 mg/dL) (p<0.001) (Tabla 2). Esto podría deberse parcialmente al mayor contenido de azúcares en la MCMz (66.8%) comparado con la MCAz (48%), lo que implica una concentración 1,4 veces más alta en la primera, aunque es insuficiente para explicar la diferencia entre estas dos fuentes. Otra posible explicación sería la mayor velocidad de hidrólisis de la MCMz comparada con la de la MCAz. Así, teniendo en cuenta los cambios en la concentración de glucosa entre el momento de la incubación y los 60 minutos, la tasa de producción de glucosa con la MCMz fue de 2.01 mg/mL/min en tanto que con la MCAz fue de 0.71 mg/mL/min, es decir, 2.83 veces más rápido. Otros autores han reportado diferencias entre fuentes de azúcar en procesos de fermentación. Así, Agrawal et al (1998) evaluaron cuatro fuentes de azúcar (jugo y melaza de caña de maíz y jugo y melaza de remolacha azucarera) y encontraron que la eficiencia en la fermentación de la melaza de la remolacha azucarera fue superior a la mostrada por la melaza de la caña de azúcar (90 vs 84%) lo que podría deberse a diferencias en la presencia de impurezas que afectarían la fermentación (Yang et al 2003). Como se mostró en la Tabla 1, la MCAz presenta un contenido muy alto de cenizas comparado con la MCMz, lo que estaría asociado con el contenido de impurezas que estarían afectando negativamente la capacidad de hidrolisis de la MCAz. Correa et al (2013) también reportaron mayor concentración de glucosa en muestras de LR a las que se les adicionó 25 mg/mL de MCMz comparada con las que recibieron MCAz (1.90 veces más alta).
El incremento en la concentración de glucosa en el LR a medida que fue avanzando el tiempo de hidrolisis, sería una consecuencia de la diferencia entre la velocidad de la hidrólisis de la sacarosa, y la velocidad de absorción y fosforilación de la glucosa al interior de las células microbianas presentes en el LR. Así, hasta los 60 minutos, la velocidad de hidrólisis fue mayor en ambas melazas con lo que se fue incrementando la concentración de glucosa, mientras que después de este periodo, la velocidad de absorción habría sido mayor que la de la hidrólisis con lo que la concentración de glucosa disminuyó. Otros autores han encontrado incrementos significativos en la concentración de glucosa en LR. Horn et al (1979) encontraron que la concentración de glucosa en el rumen de novillos Holstein puede ser de hasta de 160 mg/dL una hora después de la suplementación con 90 g/kgPV0, 75 de maíz con alta humedad. Este valor fue inferior al hallado en este trabajo con la MCMz pero superior al que se encontró MCAz. Una cifra similar (162 mg/dL) fue reportada por Elsden (1945) evaluando la fermentación de glucosa en licor ruminal de ovejas. Según este autor, la tasa de fermentación de la glucosa fue baja durante la dos primeras horas lo que se reflejó en la acumulación de la glucosa en el LR y la baja producción de ácido láctico.
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| Figura 1. Efecto del tiempo de incubación de melaza de
caña de maíz y melaza de caña de azúcar sobre la concentración de glucosa en licor ruminal |
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| Figura 2. Cambios en el pH luego de la incubación de melaza de caña de azúcar o melaza de maíz en LR comparados con el tratamiento control |
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Tabla 2. Efecto de la fuente de melaza sobre el contenido de glucosa y el pH promedio luego de la incubación in vitro. |
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Glucosa |
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Fuente |
g/dL |
pH |
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Melaza de caña de azúcar |
51.4 |
5.53 |
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Melaza de caña de maíz |
199 |
5.55 |
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EEM |
17.1 |
0.0054 |
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P |
0.0009 |
0.0185 |
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EEM: error estándar de la media |
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No obstante que la producción de glucosa fue más alta con la MCMz, los cambios en el pH fueron similares a los que se encontraron con la MCAz. Así como se muestra en la grafica 2, el pH en el LR descendió rápidamente luego de la incubación de las dos fuentes de tal manera que a los 15 minutos este descenso correspondió a cerca de 0.04 unidades de pH. Valores similares fueron reportados por Correa et al (2013) con las mismas fuentes. Sin embargo, a los 120 minutos el descenso de pH en este trabajo fue menor que el reportado por Correa et al (2013) quienes encontraron valores de 5.40 unidades de pH para la MCAz y 5.30 para la MCMz. Oba et al (2015) reportaron, igualmente, una caída rápida en el pH ruminal de 5.62 unidades en las tres primeras horas en vacas Holstein secas a las que suplementaron con 3.0 kg de sacarosa. Por el contrario, aquellas vacas que suplementaron con 3.0 kg de lactosa o 2.85 kg de almidón de maíz no mostraron una caída significativa en el pH. El decenso en el pH a los 240 minutos fue de 5.45 con la MCMz y 5.42 con MCAz. Nikolov (1998) reportó una caída más pronunciada del pH en bufálos jóvenes (5.3) al ser suplementados con 20 mL/Kg de PV de MCAz.
La Figura 3 muestra la cinética de la hidrólisis de la urea en el LR. Como se aprecia, la hidrólisis fue prácticamente completada en los primeros 30 minutos de incubación presentando un parámetro b de cerca del 98% y una constante de hidrólisis de 21.2/h. Existen muy pocos trabajos en los que se hayan estimado los parámetros de la cinética ruminal de la urea. Makkar y Singh (1987) coinciden en señalar que el modelo que explica la hidrólisis de la urea es similar al obtenido en este trabajo, esto es, H% = 100 (1-exp(-k*t)), esperando que la hidrólisis sea, por supuesto del 100%. El NRC (2001) señala que la urea es altamente soluble y que es totalmente hidrolizada en el rumen. Marichal et al (2009), por su parte, evaluando la cinética de la hidrólisis de urea protegida encontró que la kd fue más baja (-3.61/h) que la hallada en este trabajo y aunque también evaluaron la cinética de la urea sin proteger, no presentan los datos de la cinética de este producto. Correa et al (2013) también evaluaron la actividad de la urea en LR y encontraron que la fracción fue del 100% mientras que la constante kd fue similar a la de Marichal et al (2009) y, por lo tanto, más baja que la encontrada en este trabajo.
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| Figura 3. Cinética de la hidrólisis de la urea en licor ruminal. Modelo Orskov y McDonald, 1979 |
En la Figura 4 se muestran los cambios en el pH ruminal luego de la adición de urea comparándolo con el control (LR sin adición de urea). Los niveles de pH en el control se mantienen constantes con promedio de 5.80. Los niveles de pH bajos en el LR podrían ser debido una producción excesiva de ácidos grasos volátiles pero dada las condiciones de los animales a los cuales se les extrajo LR puede deberse a una absorción insuficiente de los ácidos grasos volátiles a través de la pared ruminal, o un aporte vía saliva o vía ingestión de insuficientes de sustancias tampones al rumen, o también a una tasa de pasaje lenta, pudiendo presentarse una acidosis crónica, caracterizada por un pH ruminal alrededor de 5.6 o una acidosis subaguda o subclínica, caracterizada por un pH entre 5.2 y 5.6.
A los primeros cinco minutos la diferencia del control con respecto la urea es 0.01 veces mayor o un 0.01%. Esta tendencia de aumento de pH continúa incrementando a medida que aumenta el tiempo y la hidrolisis de la urea en el LR, llegando a un punto máximo a los 150 minutos de pH 6.77 con una diferencia con respecto al control 1.16 veces mayor o un 14.4%. Luego de llegar a este punto el nivel de pH de la urea desciende a 6.55, disminuyendo alrededor de - 0.22 unidades a los 240 minutos. Se observa que a medida que aumenta la hidrolisis de urea debido a la accion de la ureasa ruminal (NRC 2001), se produce una mayor cantidad de amoniaco a causa de la hidrolisis de esta, elevando los niveles de pH en el LR. Ojeda et al (2012) evaluaron parámetros de la fermentación ruminal el LR con la adición de 150 g de urea y NNP de liberación controlada de 75 g de urea y 91.7 g de NNP de liberación controlada. La incorporación de fuentes suplementarias de NNP no modificó (p>0.05) el pH del líquido ruminal, el cual se ubicó entre 5.9 y 6.3, con un valor medio de 6.2 ± 0.19. Comparado con el control (19.1 mg N-NH3/L), se observó un aumento (p<0.01) del contenido de N-NH3 en el líquido ruminal de 9.1 veces para los tratamientos Urea y Urea/NNP de liberación controlada, y de 14.8 veces en el tratamiento NNP de liberación controlada.
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| Figura 4. Cambios en el pH ruminal luego de la adición de urea comparado con el Control (LR sin adición de urea) |
A CEAGRO por facilitar las instalaciones y los animales del Centro de Producción Paysandú así como las instalaciones del Laboratorio de Ciencias Animales para los análisis de laboratorio. Al Laboratorio de Bromatología por facilitar sus instalaciones y equipos para el análisis de las muestras. A los trabajadores del Centro de Producción Paysandú durante la ejecución del trabajo de campo.
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Received 10 June 2015; Accepted 23 February 2016; Published 1 April 2016