Parámetros de fermentación ruminal in vitro del pasto Kikuyo (Pennisetum clandestinum)

Alejandra Marín G, Luis Alfonso Giraldo V* y Guillermo Correa**

Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Medellín, Colombia
amaring@unal.edu.co
* Laboratorio de Biotecnología ruminal- BIORUM, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín.
** Departamento de Ciencias Agronómicas, Universidad Nacional de Colombia - Sede Medellín

Resumen

Se determinaron los principales parámetros de la fermentación ruminal in vitro de muestras del pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) provenientes de 19 fincas, ubicadas en cinco municipios de clima frío del departamento de Antioquia.  Se realizaron incubaciones in vitro de las muestras con tiempos de incubación de 24 y 48h). Se utilizaron botellas de vidrio con capacidad para 110 ml en los cuales se adicionó 0,5 g de la muestra del pasto seco mas 40 ml de medio de cultivo inoculado con 10 ml de líquido ruminal.  Se midió el volumen de gas producido utilizando un transductor de presión y se tomaron muestras para analizar la producción de metano y otros parámetros de la fermentación ruminal.

La composición química y los parámetros de la fermentación ruminal variaron entre las muestras de Kikuyo procedentes de diferentres municipios, pero no hubo relación entre los indices mas importantes de la fermentación ruminal (la proporción molar del ácido propiónico y el metano) y los parametros claves de la composición quimica (proteína cruda, digestibilidad in vitro, fibra detergente neutra) de las muestras del pasto Kikuyo.  Hubo diferencias marcadas en el contenido de metano en el gas a las 24 y 48h, siendo el doble la concentración a las 48 que a las 24h. La producción de metano por unidad de sustrato digerido a las 24h fue 80% mayor comparado con la producción por unidad de sustrato original; en cambio, a las 48h la diferencia fue solamente el 51%. Estos resultados indican que el incremento del metano a las 48 h en comparación con lo del 24h es porque a  las 48h la mayoría de la producción de metano se obtuvo a partir del ácido acético según la vía de la fermentación secundaria, más bien que por la fermentación del sustrato original.

Las implicaciones de estos resultados son que las incubaciones in vitro no deberían extenderse más que las 24h, cuando se pretende simular las condiciones dentro del rumen de un animal rumiante, ya que a las 48h las condiciones se relacionan más a las que occuren en un biodigestor anaeróbico.

Palabras claves: AGV, digestibilidad, duración de fermentación, energía metabolizable, metano, razón propionico:acetico

In vitro rumen fermentation of Kikuyo (Pennisetum clandestinum) grass

Abstract

Samples of Kikuyu grass (Pennisetum clandestinum) from 19 farms located in five municipalities in the Antioquia Department of Colombia were analysed for proximate constituents and for the principal end productos of the fermentation determined in vitro incubations with rumen fluid.

The chemical composition and rumen fermentation parameters varied between the samples from the different municipalities, but there was no relationship between the main indices of ruminal fermentation (molar ratio of propionic:acetic acid and methane) and the key parameters of the chemical composition (crude protein, in vitro digestibility, neutral detergent fiber) of the dry matter of the samples of Kikuyu grass. There were marked differences in the methane content in the gas at 24 and 48h , with twice the concentration found at 48 than at 24 hours. Per unit of original substrate, methane production at 24h was 60 % higher compared to the production per unit substrate digested, whereas at 48h the difference was only 10%. These results indicate that the increased production of methane at 48 h compared to that at 24h was because most of the production of methane at 48h was deriuved from acetic acid according to the secondary fermentation pathway, rather than by fermentation of the original substrate.

The implications of these results are that in vitro incubations, intended to simulate the conditions within a ruminant animal, should not extend for much more than 24 hours, because at 48h the conditions relate more to those in an anaerobic biodigester.

Key words: digestibility, incubation time, metabolizable energy, methane, ratio propiónic:acetic acids, VFA

Introducción

En las subregiones norte y oriente el departamento de Antioquia, como una extensión de lo que sucede en las explotaciones lecheras ubicadas en el trópico alto colombiano, los sistemas de producción lechera con ganado bovino especializado, se caracterizan por utilizar dietas basadas en pasturas de kikuyo (Pennisetum clandestinum) suplementadas con alimentos balanceados (concentrados). Aunque el Kikuyo es la gramínea de mayor abundancia y la más conocida por productores y técnicos del sector lechero aún se desconoce muchos aspectos asociados a la calidad nutritiva y principales parámetros de fermentación ruminal que tienen un efecto importante tanto en la economía nacional como en el impacto ambiental dada la significativa participación de este subsector productivo.

La técnica in vitro de producción de gas se ha utilizado ampliamente en los últimos 20 años para la evaluación de alimentos (Pell et al 1997) como también para medir la producción de metano de una amplia gama de forrajes (Lovett et al 2006; Tavendale et al 2005). Esta técnica permite determinar la extensión y la cinética de degradación de un alimento a través del volumen de gas producido durante el proceso fermentativo (Theodorou et al 1994), siendo la producción de gas el resultado de la fermentación de los carbohidratos a los ácidos acético, propiónico y butirico, y los gases CO₂ y CH₄ (Wolin 1960; Beuvink y Spoelstra 1992; Blummel y Ørskov 1993; Getachew et al 1998). Un factor que afecta la producción de metano es la relación entre sí de los ácidos grasos volátiles (AGV) producidos, la cual regula la producción de hidrógeno y la subsecuente producción de metano (Johnson y Johnson 1995). Dada la importancia actual del calentamiento global a causa de las emisiones de gases de efecto invernadero (GEI) y del incremento del metano de origen antropogénico en los últimos años (Van Aardenne et al 2001), conocer la emisión de metano producto de la fermentación de pasturas de mayor utilización, no solo es una necesidad si no también una herramienta útil para la implementación de nuevas estrategias de mitigación de GEI.

Objetivos

Conocer los principales parámetros de la fermentación ruminal in vitro del pasto kikuyo, proveniente de fincas lecheras del departamento de Antioquia.

Materiales y Métodos

Localización

Con base en el inventario ganadero y los volúmenes de leche producida se seleccionaron cinco municipios del departamento de Antioquia (San Pedro de los Milagros, Yarumal, La Unión, Santa Rosa de Osos y Entrerrios) para tomar muestras de pasto kikuyo ofrecidos al ganado lechero. El trabajo experimental se realizó en el laboratorio de Biotecnología Ruminal –BIORUM–, perteneciente al Departamento de Producción Animal de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín el cual se encuentra a una altura de 1.538 msnm y temperatura promedio de 24°C.

Sustratos

En los municipios de San Pedro de los Milagros, La Unión, Santa Rosa de Osos y Entrerrios se seleccionaron cuatro fincas por municipio y en el municipio de Yarumal se seleccionaron tres fincas, para un total de 19 fincas muestreadas en el Departamento de Antioquia. En cada finca se tomaron muestras de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum), utilizando la técnica “Hand Pluck” (Euclides et al 1992), para garantizar una muestra representativa de lo que las vacas en pastoreo seleccionan y consumen.

La altitud fue tomada en cada finca de los municipios evaluados mediante un sistema de posicionamiento global (GPS). Dentro de los municipios de la región norte de Antioquia se encuentran San Pedro de los Milagros el cual se halló a una altitud promedio de 2593 +/- 41,30 msnm y una temperatura promedio de 16°C, Yarumal con una altitud promedio de 2126 +/- 212,01 msnm y temperatura promedio de 15°C, Entrerrios con altitud y temperatura promedio de 2395 +/- 11,9 msnm y 16°C respectivamente y Santa Rosa de Osos, que está a una altitud promedio de 2585 +/- 46,4 msnm y una temperatura promedio de 13°C. En la región del Oriente Antioqueño se muestreó el municipio de La Unión el cual se encuentra a una altura promedio de 2495 +/-28,1 msnm y una temperatura de 13°C.

Caracterización química

Los pastos fueron secados por 48 horas en estufa de aire forzado a 60° C hasta alcanzar un peso constante y luego molidos en un molino Fritsch (Idar Oberstein®- Germany), luego pasaron por una criba porosa, con un diámetro de 1 µm. Posteriormente, se les determinó el contenido de nitrógeno mediante el método Kjeldhal (AOAC 1999) en un equipo VELP Scientifica®.  Los contenidos de Fibra en Detergente Neutro (FDN), Fibra en Detergente Ácido (%FDA) y Lignina (LIG) fueron determinados por la técnica secuencial descrita por Van Soest et al (1991). La determinación de cenizas (CEN) se obtuvo por incineración directa a 500°C por dos horas, usando una mufla, según el método.  La materia orgánica (MO) fué calculada por la diferencia entre los valores de la materia seca (MS) y CEN. Se determinó el extracto etereo con un analizador de grasa ANKOM XT15 mediante el método Soxhlet en el cual se utiliza éter de petróleo como solvente extractor de grasa a una temperatura de 90°C por una hora (AOAC 1999). La digestibilidad in vitro de la materia seca (DIVMS) se determinó a las 48h, utilizando un incubador DaisyII® de la marca ANKOM (Ankom technology 2004), siguiendo la metodología descrita por Goering y Van Soest (1970).

Fermentación ruminal in vitro

Los parámetros de fermentación fueron evaluados mediante la técnica de producción de gas in vitro descrita por Theodorou et al (1994), para lo cual se diseñaron 10 experimentos o incubaciones in vitro independientes, uno por cada municipio (San Pedro de los Milagros, Yarumal, La Unión, Santa Rosa de Osos y Entrerrios) y tiempo de incubación (24 y 48h). Cada experimento estuvo conformado por 20 botellas constituidas por 4 pastos, 4 líquidos ruminales (provenientes de 4 vacas Holstein), un tiempo de incubación (24 horas) más 4 blancos (1 por animal). Bajo el mismo esquema se diseñaron los experimentos de las 48 horas. Los blancos solo contenían medio de cultivo e inoculo pero no sustrato, y fueron utilizados para corregir la presión generada por el gaseado con CO₂ y la presión producida por la fermentación producto de los microorganismos ruminales presentes en el líquido ruminal incubado (López et al 1998; Theodorou et al 1994).

En cada experimento se utilizaron botellas de vidrio con capacidad para 110ml, en cada una de las cuales se adicionó 0,5 g de la muestra del pasto seco. Posteriormente se recolectó líquido ruminal en la horas de la mañana proveniente de cuatro vacas canuladas al rumen las cuales consumieron una dieta compuesta por una mezcla de pasto kikuyo (Pennisetum clandestinum) y suplemento concentrado, ubicadas en la Estación Agraria Paysandú de la Universidad Nacional de Colombia. El líquido ruminal se obtuvo mediante el filtrado del contenido ruminal extraído a través de la cánula en un lienzo con un tamaño de poro de 0,45 mm, para ser luego depositado en un termo precalentado a una temperatura de 39°C y trasladado inmediatamente al laboratorio. El líquido fue filtrado nuevamente usando una bolsa de nylon con un tamaño de poro de 53 μm, con el fin de retirar los sedimentos y residuos de pasto. Se gaseó permanentemente con CO₂ y se mantuvo a una temperatura constante de 39°C. Posteriormente, a cada frasco con sustrato le fue agregado medio de cultivo (40ml) e inoculado con 10 ml de líquido ruminal, gaseando continuamente con CO₂. El medio de cultivo usado es el descrito por Goering y Van Soest (1970), que contenía CaCl₂•2H₂O; MnCl₂•2H₂O; CoCl₃•6H₂O; FeCl₃•6H₂O; Na₂HPO₄; KH₂PO₄; MgSO₄•7H ₂O; NaHCO₃; (NH4) HCO₃; Resarzurina; Na₂S; L-Cisteína HCl, sin tripticasa y líquido ruminal para una relación 4:1. Luego las botellas fueron selladas herméticamente con tapones de caucho y agrafes de aluminio, agitadas suavemente y trasladadas a una incubadora que se mantuvo a una temperatura constante de 39°C.

Una vez transcurridas las 24 y 48 horas de incubación, se midió el volumen de gas producido utilizando un transductor de presión al cual se le adaptó una válvula de tres salidas. La primera salida conectada a una aguja (0.8 mm), la segunda conectada al transductor de presión y la tercera a una jeringa plástica de 100 ml utilizada para tomar la muestra del gas producido durante la fermentación y a partir de la cual se determinó la concentración de metano mediante cromatografía de gases. El volumen de los gases producto de la fermentación se calculó con un modelo de regresión validado en el laboratorio.  Seguidamente, se abrieron las botellas para medir el pH y tomar muestras para analizar las concentraciones de nitrógeno amoniacal (N-NH₃) y ácidos grasos volátiles (AGV) siguiendo el procedimiento de Giraldo et al (2007).  Se tomaron muestras del gas para determinar la producción de metano (CH₄) en cada muestra. El contenido de cada botella se filtró a través de crisoles Pirex® con placa porosa (nº1), y se secó en estufa de aire forzado a 60°C durante 48 horas para determinar la degradabilidad de la materia seca (DMS).

Para determinar la degradabilidad de la pared celular, la materia seca residual de todas las botellas se depositó en bolsas filtrantes Ankom F57 (ANKOM Technology Corp Fairport NY) y posteriormente se sometió a una extracción con detergente neutro y acido a 100 °C siguiendo el método propuesto por Goering y Van Soest (1970) usando para ello un analizador de fibra ANKOM 200 (ANKOM Technology Corp Fairport NY) y así obtener finalmente la degradabilidad de la fibra en detergente neutro (DFDN) y detergente ácido (DFDA). Al finalizar cada uno de los procedimientos el pH en los efluentes producto de la fermentación ruminal in vitro, se cuantificó mediante un pH-metro (Schoot Instruments® Modelo 2006).

Nitrógeno amoniacal (N-NH₃)

Después de finalizar el proceso fermentativo, se tomó una alícuota de 5 ml del efluente (medio de cultivo, liquido ruminal y sustrato) para llevarla a un tubo Falcon® que contenía ácido clorhídrico al 0,5 N (dilución 1:1). Posteriormente, estas muestras fueron centrifugadas a 4000 rpm durante 4 minutos a 4ºC en una centrífuga marca Biofuge Primo R Heraeus®. Seguidamente, se tomó el sobrenadante que fue depositado en frascos Falcon® refrigerados a 4ºC. Se determinó la concentración del nitrógeno amoniacal (N-NH₃) en las muestras de pasto siguiendo el procedimiento descrito por la AOAC (1999), utilizando un electrodo selectivo de amonio ISE-N-NH₃. Para determinar la concentración de N-NH₃ en las muestras se realizó una curva de calibración utilizando soluciones con concentración conocida de amonio.

Acidos grasos volátiles (AGV)

Una vez interrumpida la fermentación de cada técnica de producción de gases se tomaron muestras del efluente de cada botella y se depositaron en viales Eppendorf® de 2 ml en los cuales se agregó una solución desproteinizante y acidificante (10% ácido metafosfórico y 0.06% ácido crotónico, p/v en HCl 0.5 N). Posteriormente se centrifugaron las muestras a 13.000 rpm por 12 minutos a 4ºC y se tomó el sobrenadante en un vial para cromatografía los cuales fueron almacenados a 4ºC hasta su análisis. Para la determinación de la concentración de AGV´s (acético, propiónico, butírico, isovalérico y valérico) de los pastos se usó un cromatógrafo de gases Shimadzu modelo GC-2014 (Shimadzu Corporation, Japón) equipado con una columna capilar de polietilenglicol Agilent HP-FFAP de 25m de longitud × 0.32 mm diámetro interno × 0.5 µm grosor de película (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA). Las condiciones empleadas en el proceso de separación fueron las siguientes: Temperatura, 260ºC para el puerto de inyección Split; temperatura de detección, 280ºC detector FID; gas de arrastre helio a velocidad constante (42 cm/segundo). El volumen inyectado fue 1µL para las muestras y los estándares. El procedimiento de cuantificación se basa en un proceso en el que las muestras de calibración (estándares) y las muestras problemas se analizan bajo las mismas condiciones. Finalmente, el resultado de la muestra evaluada se compara con el de la muestra estándar.

Metano (CH₄)

Las muestras de metano se tomaron del gas producido en cada botella incubada en la técnica de gases y se depositaron en tubos vacutainers al vacío de 6 ml (Venoject®) a partir de los cuales se determinó la concentración de metano utilizando un cromatógrafo de gases (GC-2014, Shimadzu Corporation, Tokyo, Japón) equipado con detector de ionización de llama (FID), una columna capilar Agilent HP-PLOT Molesieve 5Å 30 m × 0.32 mm D.I y 12 µm grosor de película (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, EUA. Se utilizó helio UAP grado 5.0 como gas de arrastre a una velocidad lineal de 35.4 cm/seg. Se utilizó un software (GC Solution, Shimadzu Corporation, Tokyo, Japón) tanto para controlar el funcionamiento del equipo como para procesar las señales generadas por el detector. La inyección de metano se efectuó manualmente y el gas patrón utilizado para determinar las concentraciones de CH₄ en el gas producto de la fermentación fue una mezcla especial de metano (CH₄) en nitrógeno (N) con un contenido de CH₄ del 10%. Los cálculos finales de metano se realizaron según la metodología descrita por Lopez y Newbold (2007).

Análisis estadístico

Los resultados de los principales parámetros de la fermentación ruminal in vitro de pastos y dietas, a las 24 y a las 48 horas, fueron comparados entre municipios, con base en el análisis de varianza correspondiente a un diseño de una vía, con muestreo aleatorio simple, para lo cual se usó el procedimiento GLM del programa estadístico SAS (2008) acorde con el siguiente modelo:

,

Donde:

Y_i muestra del i-ésimo municipio, µ media general de los municipios, M_i la diferencia entre la media del i-ésimo municipio y la media general,  €_ij  la variación aleatoria. Cuando se detectaron efectos significativos (P<0.05), se efectuó la comparación de medias, utilizando el procedimiento Tukey (SAS 2008), con un nivel de significancia del 5%.

Resultados y discusión

Composición química

En general, los resultados de composición química y digestibilidad (Tabla 1) fueron semejantes a los encontrados por otros autores (ej: Correa et al 2008) y demuestran que el Kikuyo es uno de los mejores forrajes tropicales en terminos de su valor nutritivo.

 Fermentación ruminal in vitro

Los parámetros de la fermentación ruminal (Tabla 2) de los pastos variaron entre si pero no presentaron relaciones consistentes con los indicadores más importantes de la fermentación ruminal (la proporción molar del ácido propiónico y la producción de metano) (Figuras 1a,b,c y 2a,b,c). Se supone que la proporción de ácido propiónico en los productos de la fermentación ruminal es el factor que más influye sobre la expresión de la  energia metabolizable de la dieta (y por tanto la tasa de producción animal) (Clarke et al 1972; Preston y Leng 1987; Ungerfield 2013); y por razones obvias es deseable que la producción de metano sea lo menor posible.

Hubo diferencias marcadas en el contenido de metano en el gas a las 24 y 48h, siendo el doble la concentración a las 48 que a las 24h (Figura 3). Resultados similares fueron reportados en incubaciones in vitro Binh Phuong et al (2011), Inthpanya et al (2011), Outhen et al (2011), Silivong et al (2012) y Thanh et al (2012). Sin embargo. la observación más interesante era del comportamiento del metano en función del sustrato original (MSi) y sustrato degradado (MSd). En ambos casos, la producción de metano se incrementó a las 48h comparado con las 24h; sin embargo, la diferencia entre los resutados a las 48 y las 24h fue notable. La producción de metano a las 24h fue 80% mayor por unidad de sustrato digerido comparado con la producción por unidad de sustrato original; en cambio, a las 48% la diferencia fue solamente el 51%.  Esto indica que la fermentación acetogénica es la principal fuente de hidrógeno para la metanogénesis en las primeras 24 horas del periodo de incubación , pero la fermentación aceticlástica de los AGV es más dominante en las segundas 24 horas de la incubación. En la mineralización completa de la materia orgánica, en condiciones anaeróbicas, un tercio del metano producido se debe a la solubilización de la materia orgánica a AGV y dos tercios surge cuando estos AGV se oxida a metano y dióxido de carbono. Los dos procesos de mineralización  ocurren simultáneamente, pero la tasa de producción de metano aceticlástica sólo alcanzará un máximo cuando la producción de AGV se optimiza. Por tanto, el incremento del metano a las 48 h en comparación a 24h es porque a las 48h la mayoría de la producción de metano se obtuvo a partir del ácido acético de acuerdo con la vía de fermentación secundaria, más bien que por la fermentación del sustrato original. Este último proceso es lo que sucede en el digestor anaeróbico (Figura 4), en el que el tiempo de retención del sustrato es mucho más largo que en el rumen del animal vivo.

Figure 1a. Relación entre la proporción del ácido propiónico en los AGV en los productos de la fermentación a las 24h y el porcentaje de proteína cruda en la MS de las muestras de pasto Kikuyu	Figure 1b. Relación entre la proporción del ácido propiónico en los AGV en los productos de la fermentación a las 24h y la digestibilidad in vitro de la MS de las muestras de pasto Kikuyu	Figure 1c. Relación entre la proporción del ácido propiónico en los AGV en los productos de la fermentación a las 24h y el porcentaje de FDN en la MS de las muestras de pasto Kikuyu
Figure 2a. Relación entre la producción de metano a las 24h y el porcentaje de proteína cruda en la MS de las muestras de pasto Kikuyu	Figure 2b. Relación entre la producción de metano a las 24h y la digestibilidad in vitro de la MS de las muestras de pasto Kikuyu	Figure 2c. Relación entre la producción de metano a las 24h y el porcentaje de FDN en la MS de las muestras de pasto Kikuyu

Estos resultados implican que las incubaciones in vitro no deberían extenderse más que las 24h, de alimentos o forrajes de alta calidad nutritiva como el pasto kikuyo evaluado, cuando se pretende simular la condiciones dentro del rumen de un animal rumiante, ya que a las 48h las condiciones se relacionan más a las que ocurren en un biodigestor anaeróbico.

Figura 3. Proporcion de metano en el gas a los 24 y 48h de fermentación en muestras de pasto Kikuyo tomadas de fincas en diferentes municipios de Antioquia	Figura 4. Esquema de producción de metano en el biodigestor anaeróbico

Conclusiones

• La producción de metano fue dos veces mas grande cuando la fermentación in vitro se extendia a 48h comparada con las 24h.
  
  
• Se sugiere que cuando se desarrollan incubaciones in vitro destinadas a la simulación de la condiciones reales en el rumen, usando como substratos alimentos o forrajes de alta calidad nutritiva como el de este ensayo, el tiempo de la fermentación no debería pasar las 24h.

Agradecimientos

Se agradecen Colciencias y la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín para el apoyo financiero de este trabajo.

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Received 17 December 2013; Accepted 16 February 2014; Published 1 March 2014

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