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| Figura 1. Evaluación de la calidad
seminal de búfalos. Valores predichos por el modelo por animal para las
características volumen eyaculado (A), concentración espermática (B) y movilidad individual (C). * Identificación del animal. |
| Livestock Research for Rural Development 25 (9) 2013 | Guide for preparation of papers | LRRD Newsletter | Citation of this paper |
El objetivo de este estudio fue evaluar la calidad seminal de 10 búfalos a partir de 102 colectas obtenidas en el momento en que los animales participaban de las pruebas de desempeño para características de carne realizadas entre 2009 y 2011 en Colombia. Se utilizó un modelo lineal mixto (MLM) para evaluar la producción de semen respecto a las características: volumen eyaculado (VE), concentración espermática (CE) pos descongelación y movilidad individual (MI) pos descongelación. Se evaluaron también mediante un MLM algunos parámetros cinéticos y características de movilidad espermática como velocidad curvilínea (VCL), velocidad rectilínea (VSL), velocidad media (VAP), índices de rectitud (STR), linearidad (LIN) y número de espermatozoides rápidos, medios lentos y estáticos. El análisis estadístico fue realizado en el programa R, mediante el procedimiento lmer de la librería lme4.
Las medias obtenidas para VE, CE y MI fueron 3.29±1.18 ml, 116±17.6 millones de espermatozoides/ml y 57.4±8.7%, respectivamente. Para las características de movilidad espermática: VCL, VSL, VAP, LIN y STR, las medias fueron 123±11.3 µm/s, 58.3±5.1 µm/s, 72.9±6.06 µm/s, 49.2±2.73% y 79.9±2.08%; y para el número de espermatozoides rápidos, medios, lentos y estáticos, los resultados promedio fueron 35.8±5.99 millones/ml, 12.1±3.48 millones/ml, 17.4±4.96 millones/ml y 50.1±13.8 millones/ml, respectivamente. El efecto fecha de colecta fue significativo para todas las características (p<0.05), y la edad fue significativa solo para MI (p<0.05). En conclusión los resultados obtenidos para las características evaluadas pre y pos descongelación están de acuerdo a lo reportado en la literatura para la especie. Desde el punto de vista de la calidad seminal, no habría limitantes para el uso de este material dentro de un programa reproductivo de hato.
Palabras clave: características seminales, modelo lineal mixto, sistemas de análisis computarizado (CASA)
The aim of this study was to evaluate the seminal quality of 102 collects obtained from 10 buffaloes. During the collection, buffaloes were participating in a performance test for meat characteristics in Colombia during years 2009 to 2011. A linear mixed model (LMM) was used to evaluate semen production from the characteristics: ejaculated volume (EV), post-thaw spermatic concentration (SC), and post-thaw individual motility (IM). Also, kinetic parameters and motility characteristics such as velocity on the curved line (VCL), velocity on the straight line (VSL), velocity on the average path (VAP), straightness (STR), linearity (LIN), and number of rapid, medium, slow, and static spermatozoids were evaluated. The statistical analysis was performed with the R program.
The mean values for EV, SC, and IM were 3.29±1.18 ml, 116±17.6 million of spermatozoids/ml, and 57.4±8.7%, respectively. For the spermatic motility characteristics VCL, VSL, VAP, LIN and STR, the mean values were 123±11.3 µm/s, 58.3±5.1 µm/s, 72.9±6.06 µm/s, 49.2±2.73%, and 79.9±2.08%; and the mean values for the number of spermatozoids with a rapid, medium, slow, and static movement were 35.8±5.99 million/ml, 12.1±3.48 million/ml, 17.4±4.96 million/ml, and 50.1±13.8 million/ml respectively. All parameters measured were significantly affected by date of collection (p<0.05); also, IM was significantly affected by age (p<0.05).
In conclusion, the results obtained for all the semen parameters evaluated pre and post-thaw were consistent with the literature reports. Thus, the seminal quality would not be a limiting factor if this semen material is wanted for a reproductive program in the farm.
Key words: computer-assisted semen analysis (CASA), linear mixed model, seminal characteristics
La calidad seminal hace referencia al conjunto de parámetros que determinan la viabilidad de la célula espermática (Gadea 2001); entre tanto, la evaluación de la calidad seminal es una herramienta que contribuye en la valoración de la fertilidad del macho, y es básica para el desarrollo exitoso de programas de mejora genética en las producciones (Kathiravan et al 2011; Sohail et al 2013).
La movilidad y morfología espermáticas, así como la integridad acrosomal, han sido relacionadas con características funcionales que permiten determinar lo apto que es un espermatozoide para realizar los procesos de capacitación, reacción acrosómica y fecundación (Canizales 2011). Así mismo, otros parámetros como volumen eyaculado, concentración espermática, movilidad individual y masal, color, densidad, porcentaje de vivos y algunas variables morfológicas más, son importantes a la hora de determinar la calidad de un eyaculado (Sansone et al 2000).
La evaluación de algunas características como morfología, concentración y movilidad espermáticas se apoyan en métodos subjetivos en búfalos y muchas otras especies con resultados aceptables. Recientemente se han introducido nuevas técnicas basadas en sistemas de análisis computarizado conocidos como CASA; éstos permiten el análisis de dichas características de forma más objetiva al describir cuantitativamente el movimiento individual de los espermatozoides, ofreciendo mayor confiabilidad sobre los valores de calidad obtenidos (Hidalgo et al 2005; Kathiravan et al 2011).
El objetivo de este estudio fue evaluar el semen de 10 búfalos con base en las características comúnmente analizadas para calidad seminal y en los parámetros de cinética espermática.
Se realizaron colectas de semen a 10 búfalos de entre 19.8 y 34.9 meses de edad. Los individuos provenían de los sistemas productivos cría sin ordeño (CSO) y doble propósito (DP), de fincas ubicadas en los departamentos de Córdoba (9 fincas) y de Caldas (1 finca) en Colombia, y que para ese momento participaban de unas pruebas de desempeño para características de carne. La colecta de semen fue realizada por medio de vagina artificial, la congelación y los análisis de calidad en fresco y pos descongelación se llevaron a cabo con protocolos de la empresa Reprovet R.v. E.u. El número de colectas por animal varió entre 3 y 18, y la toma de una colecta a otra varió entre 2 y 119 días. Se analizaron en total 102 colectas, de las cuales 75 fueron aptas para su procesamiento y posterior almacenamiento en pajillas de 0.5ml cada una, sumando en total 3279 dosis.
Las características color, densidad, volumen eyaculado (VE), movilidad masal (MM), movilidad individual (MI) y porcentaje de normales (PNORM) se analizaron con métodos subjetivos; la concentración espermática (CE) fue estimada a través de espectrofotometría. Las características velocidad curvilínea (VCL), velocidad rectilínea (VSL), velocidad media (VAP), linearidad (LIN), rectitud (STR), y aquellas basadas en VCL como número de espermatozoides rápidos, medios, lentos y estáticos, fueron analizadas pos descongelación por medio del sistema CASA. El análisis de las características color, densidad, MM, VE, PNORM en fresco, CE y MI en fresco y pos descongelación, y movilidad individual progresiva (MIP) pos descongelación, se realizó con la información proveniente de las colectas de los 10 animales; mientras para el resto de características solo se contó con información de 9 de éstos, debido a que uno no contaba con suficientes colectas para el análisis.
Para la evaluación de las características VE, CE pos descongelación, MI pos descongelación, VCL, VSL, VAP, LIN, STR y número de espermatozoides lentos y estáticos se implementó un modelo lineal mixto; en el procedimiento se definió que la distribución de la variable de respuesta era gaussiana (normal), y se usó la función de enlace “identidad”; la estructura del modelo se describe a continuación.
Donde:
Yijklm es el vector de observaciones para cada característica en el i-ésimo sistema productivo de la j-ésima fecha de colecta, del k-ésimo grupo contemporáneo (animales de edad similar que se mantuvieron bajo condiciones iguales durante el mismo periodo de tiempo), del l-ésimo animal de la m-ésima colecta evaluada; µ es la media general, τi es el efecto fijo sistema de producción, donde i hace referencia a uno de dos sistemas: CSO o DP; γj es el efecto fijo fecha de colecta, donde j varía de 1 hasta 24 para VE, CE y MI, y de 1 hasta 19 para el resto de características; β1 es el coeficiente de regresión lineal del efecto fijo edad; pi:k es el efecto aleatorio grupo contemporáneo, donde k varía de 1 hasta 4 y se encuentra anidada dentro del sistema productivo i; ai:k:l es el efecto aleatorio del individuo, donde l varía de 1 hasta 10 para VE, CE y MI, y de 1 hasta 9 para el resto de características, l se encuentra anidado dentro del grupo contemporáneo k; εijklm es el efecto residual.
Para la evaluación de las características número de espermatozoides rápidos y medios se utilizó la misma estructura del modelo lineal mixto; sin embargo el análisis se hizo por medio de un modelo mixto lineal generalizado, esto debido al incumplimiento de los supuestos de normalidad y homocedasticidad de dichas variables cuando eran analizadas bajo el modelo lineal mixto; en el procedimiento se definió que la distribución de la variable respuesta era Poisson, y se utilizó la función de enlace “Log”.
Los análisis estadísticos se llevaron a cabo por medio del programa R (RCore-Team 2012a), utilizando el procedimiento lmer de la librería lme4 (Bates et al 2012). La normalidad de los residuos de los modelos se probó mediante los métodos Shapiro-Wilk y Kolmogorov-Smirnov corrección Lilliefors; para ello se utilizaron las funciones shapiro.test de la librería Stats (RCore-Team 2012b), y lillie.test de la librería Nortest (Gross and Ligges 2012) respectivamente. La homogeneidad de varianzas de los residuos fue verificada por medio de las pruebas de Bartlett y Cochran, las funciones bartlett.test de la librería Stats (RCore-Team 2012b), y cochran.test de la librería Outliers (Komsta 2011) fueron usadas. La variable VE fue normalizada utilizando una transformación de la familia Box-Cox; se usó un lambda (λ) de 0.38, el cual se calculó mediante la función lm.boxCox de la librería lmSupport (Curtin 2012).
Para las características cualitativas color, densidad y movilidad masal se encontró que el 55.9% de las colectas fueron color marfil y 41.2% crema; 63.7% de los eyaculados resultaron con densidad cremoso y el 33.3% lechoso; respecto a la movilidad masal, el 4.9% de las colectas se encontraron con MM ausente, 19.6% aceptable, 24.5% buena, 21.6% muy buena y 26.5% excelente. Lo anterior es comparable a lo obtenido por Koonjaenak et al (2007), quienes al analizar 115 eyaculados provenientes de 5 búfalos, encontraron que 47.5% eran color marfil y 50% crema; así mismo, 52.5% tenían densidad cremoso y 44.1% lechoso. En una revisión realizada en el 2009, Bhakat et al mostraron variaciones en la MM entre aceptable y buena reportadas por diferentes trabajos, siendo la segunda la más frecuentemente encontrada.
La valoración seminal con pruebas de rutina para características macroscópicas, es muy útil como indicador inicial de la calidad del semen. El espermiograma del semen fresco que incluye entre otras características, color, densidad y MM, es una herramienta base para la pre-selección de un animal candidato para la preservación de su material seminal.
En cuanto a las características VE, CE y MI se encontraron variaciones entre 0.5 y 10 ml para el VE, 720 y 1700 millones de espermatozoides/ml para la CE y entre 10 y 85% para la MI. Variaciones en un rango más estrecho han sido reportados entre 3 y 4 ml (Koonjaenak et al 2007a), entre 1.79 y 3.61 ml (Bhakat et al 2011), entre 3.33 y 4.16 ml (Samo et al 2005), y entre 0.8 y 5.7 ml (Koonjaenak et al 2006). Por otra parte, valores similares a los hallados para la CE en fresco en este estudio fueron reportados por otros autores (Muhammad et al 2000; Koonjaenak et al 2007a; Ferrer et al 2010; Bhakat et al 2011). Finalmente, para la MI en fresco, valores entre 61 y 72% se encontraron en otros estudios para la especie bufalina (Mandal et al 2000; Samo et al 2005; Bhakat et al 2011).
Al analizar el volumen eyaculado por medio del modelo lineal mixto, se encontró que el efecto fijo fecha de colecta fue significativo para esta característica (p=0.0439); se halló una media ajustada de 1.48±0.59 para los valores transformados, sin embargo al recalcular este valor para eliminar la transformación se obtiene la media de volumen real, 3.29±1.18 ml. Según Vale (2011), para un reproductor normal el valor medio de volumen eyaculado es de 3 ml, con una variación entre 1 y 8 ml. Diferentes autores han reportado valores medios entre 2.25 y 3.15 ml (Abdel-Khalek et al 2008; Bhakat et al 2011; Kaka et al 2012). El volumen seminal producido y el número de espermatozoides viables, determinan el número de dosis generadas por un eyaculado; en general, en inseminación artificial (IA), se utilizan pajillas de 0.25 ml ó 0.5 ml, con concentraciones entre 120 y 150 millones de espermatozoides/ml (Sansone et al 2000). Algunos factores pueden afectar la cantidad de eyaculado producido; es el caso de la época del año, la raza, la edad y el estado nutricional del animal (Muhammad et al 2000; Ferrer et al 2010; Canizales 2011), razón por la cual deben ser tenidas en cuenta para el desarrollo de los programas de IA en el hato.
Finalmente, para la evaluación morfológica del semen se utilizó como referente el porcentaje de espermatozoides normales presentes en el eyaculado, encontrándose para este estudio que el PNORM varió entre el 65 y 75%; esto es inferior a lo reportado por algunos autores que hallaron valores medios por encima del 80% (Mandal et al 2000; Koonjaenak et al 2007a; Koonjaenak et al 2007b); sin embargo es similar a lo encontrado en otro estudio, donde se obtuvieron valores entre 68.5 y 76.7% (Ferrer et al 2010). Según Vale (2011), el porcentaje de espermatozoides normales es una característica importante cuando se desea criopreservar el semen, y en un eyaculado promedio debe ser ≥70%. Aunque el PNORM no es una característica que por sí sola sea suficiente para determinar el potencial fertilizante de un macho, si es un parámetro necesario para valorar la viabilidad del material seminal.
La movilidad individual progresiva es importante al determinar la viabilidad de un espermatozoide y su potencial fecundante; se encontró que la MIP varió entre 17.1 y 62.4%, con una media de 40.2±9.83%. Selvaraju et al (2008) reportaron una media de 46.4%, con variaciones entre 35 y 56.7% para esta misma característica. En una publicación más reciente se documentan valores medios entre 15.3±8% y 31.3±6.5% (Sohail et al 2013).
Para la concentración espermática y la movilidad individual pos descongelación, el efecto fecha de colecta resultó significativo (p=4.52e-05 y p=0.0376 respectivamente); se encontró además que para la MI, la edad del animal también tuvo efecto significativo (p=0.0446). Medias ajustadas de 116±17.6 millones de espermatozoides/ml y 57.4±8.7%, fueron halladas por el modelo para CE y MI respectivamente.
En un estudio sobre fertilidad, se encontró que concentraciones entre 15 y 30 millones de espermatozoides/0.5ml (30 y 60 millones de espermatozoides/ml), presentan tasas de fertilidad admisibles, entre 49.3 y 56.8% (Andrabi et al 2006). Para la MI, una media de 43.3±3.40*% (*Error estándar EE) fue hallada para búfalos Kundhi en Pakistán (Kaka et al 2012); mientras para búfalos de pantano en Tailandia, se hallaron valores entre 32.5±12.4% y 46.1±18.3% (Koonjaenak et al 2006); igualmente, variaciones entre 34.8 y 64% y entre 57.5 y 62.6% fueron reportadas por diferentes autores para búfalos de raza Murrah y Surti respectivamente (Bhakat et al 2009).
El análisis de estas características pos descongelación es imprescindible en la implementación de los programas reproductivos, ya que son indicadores de la permanencia de la calidad hallada en el semen fresco luego de toda la manipulación realizada durante el proceso de congelación. Sería ideal si los resultados obtenidos en el espermiograma en fresco para variables como concentración, movilidad y morfología, se mantuvieran lo más estables posible después de la descongelación del material seminal; sin embargo esto es difícil de lograr, y requiere de un extremo cuidado en cada etapa de procesamiento del semen. La evaluación de las características seminales por medio de pruebas más objetivas permite un mayor acercamiento a los valores reales de calidad, por lo que se considera adecuado incluirlo en este análisis; estas pruebas contribuyen a estimar de forma más precisa, la magnitud de los daños causados al semen durante su procesamiento.
Para los parámetros de velocidad curvilínea, velocidad rectilínea y velocidad media, se encontraron medias ajustadas de 123±11.3 µm/s, 58.3±5.1 µm/s y 72.9±6.06 µm/s respectivamente. El efecto fijo fecha de colecta resultó significativo para todas las variables (p<0.01). Valores inferiores a los obtenidos en este trabajo fueron reportados recientemente con medias de 39.3±4.38 µm/s, 15.7±5.66 µm/s y 21.5±6.42 µm/s para VCL, VSL y VAP en espermatozoides inmediatamente después de la descongelación, y valores de 29±4.7 µm/s, 9.11±3.11 µm/s y 13.4±3.36 µm/s para las mismas variables después de la incubación por 2 horas a 37°C (Rastegarnia et al 2012). Por el contrario; para 18 búfalos de agua evaluados en diferentes épocas del año, se hallaron valores medios entre 127±15.8 µm/s y 133±13.5 µm/s para VCL, 87.8±11.8 µm/s y 95.2±10.5 µm/s para VSL, y entre 90.1±12.6 µm/s y 98±10.5 µm/s para VAP (Koonjaenak et al 2007c).
El efecto fijo fecha de colecta también resultó significativo para los índices de linearidad y rectitud (p<0.001). La media del porcentaje de LIN fue 49.2±2.73%, mientras para STR fue 79.9±2.08%. Estos valores son superiores a los obtenidos por Rastegarnia et al (2012), quienes encontraron medias de 34.8±2.65% para LIN y 68.5±6.42% para STR en espermatozoides inmediatamente después de la descongelación, y valores de 29.5±6.07% y 67.4±5.44% para las mismas variables después de la incubación por 2 horas a 37°C. Valores mayores fueron encontrados en el 2006 en un estudio en bovinos de raza Frisona y Rubia Gallega, donde la media de LIN variaba entre 62.2±4.25% y 63.8±4.34% para animales frisones >3 y <3 años respectivamente, y entre 60.7±4.39% y 61±3.47% para toros rubios <3 y >3 años; para STR los valores hallados estuvieron entre 80.9±2.78% y 81.9±2.61% para frisones >3 y <3 años y, entre 80.6±2.75% y 80.8±2.09% para rubios <3 y >3 años respectivamente (Muiño et al 2006).
Finalmente el número promedio de millones de espermatozoides por ml en las categorías rápidos, medios, lentos y estáticos fue 35.8±5.99, 12.1±3.48, 17.4±4.96 y 50.1±13.8 millones respectivamente. El efecto fijo fecha de colecta fue significativo para las variables espermatozoides rápidos, medios y estáticos (p=5.94e-10, p=0.000481 y p=0.000833 respectivamente). Lo anterior muestra que alrededor del 57% de los espermatozoides presentes en las muestras analizadas son móviles; esto es similar a lo encontrado en 2012 en Irán, donde la movilidad presentada fue 51% (Rastegarnia et al 2012), sin embargo valores por encima del 70% fueron reportados recientemente para diferentes animales evaluados en Pakistán (Sohail et al 2013). Teniendo en cuenta que la movilidad pos descongelación no debe ser menor al 30% (Vale 2011), los resultados obtenidos para las muestras evaluadas en este análisis se consideran buenos.
La utilización del CASA es una práctica que cada vez se hace más habitual para evaluar en forma objetiva la movilidad espermática. Se sabe que los parámetros de movilidad están correlacionados con la fertilidad obtenida en los programas de IA (Kathiravan et al 2011); sin embargo en búfalos, mientras no se tenga la facilidad ya sea por infraestructura o por medios económicos para utilizar el CASA, se sugiere la evaluación espermática por medio de las pruebas de rutina mencionadas hasta ahora, ya que como dice Madrid-Bury (2005), las características cinéticas y morfológicas no son suficientes para determinar el potencial de fertilidad de una muestra de semen. Es importante resaltar que al determinar la movilidad, no se toma en consideración la habilidad de las células espermáticas para desarrollar ciertos procesos importantes para la fertilización in vivo como son la capacitación, la reacción del acrosoma y la fertilización; por ello, tanto para toros como para búfalos, se considera necesario realizar pruebas in vitro que permitan evaluar dichas habilidades, y ayuden a establecer con mayor confiabilidad la capacidad de fertilización de una muestra.
No se halló un efecto significativo del sistema de producción sobre ninguna de las características evaluadas, esto se atribuye al hecho de que los animales tuvieron un período de adaptación previo a la realización de las pruebas de desempeño en que participaron.
Para todas las características se encontró que existen diferencias marcadas en la calidad y cantidad del semen analizado, tanto entre individuos como dentro de un mismo individuo.
En las Figuras 1 y 2 se muestran los valores estimados por los modelos para las variables analizadas.
En la Figura 1 se grafican por animal las características volumen eyaculado (panel A), concentración espermática (panel B) y movilidad individual (panel C). Se observa una leve tendencia por parte de los valores en CE a disminuir en la medida que aumenta el VE; no se evidencia una relación clara entre la movilidad individual MI, con el VE y la CE.
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| Figura 1. Evaluación de la calidad
seminal de búfalos. Valores predichos por el modelo por animal para las
características volumen eyaculado (A), concentración espermática (B) y movilidad individual (C). * Identificación del animal. |
En la Figura 2, las características de movilidad espermática se encuentran
graficadas para el total de las colectas analizadas (incluye los 9 animales). En
el panel C se observa mayoría de espermatozoides sin movimiento, seguidos en
número por aquellos que presentan movimiento rápido, lento y medio; aunque el
número de espermatozoides estáticos es mayor, lo realmente importante es que la
totalidad de espermatozoides móviles supera el 50%.
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| Figura 2. Gráficos de caja para la totalidad de
colectas analizadas. Resumen de los valores estimados por los modelos
para las características de movilidad espermática VCL, VSL y VAP (panel A), LIN y STR (panel B), y Espermatozoides rápidos, medios, lentos y estáticos (panel C). |
Este trabajo se presenta como resultado del periodo como joven investigador Colciencias del primer autor. Esta investigación tuvo el apoyo del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, la Asociación Colombiana de Criadores de Búfalos, la Corporación Universitaria Lasallista y la Universidad de Antioquia, con el proyecto “Pruebas de desempeño en baby búfalos y búfalos doble propósito en procura de seleccionar los mejores individuos para características relacionadas a la producción y rendimiento de carne” 044-2008H7447-3212. También contó con el apoyo de la estrategia de Sostenibilidad CODI-UdeA 2013-2015, asignado al grupo GaMMA. Agradecemos especialmente a la empresa Reprovet R.v. E.u., por todo el apoyo logístico y de acompañamiento en el trabajo reproductivo y congelación de semen.
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Received 28 April 2013; accepted 7 Ago 2013; Published 4 September 2013