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Figura 1.
Electroforesis de la genotipificación por PCR-RFLP con la enzima SacII del gen β-LG caprina. |
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El objetivo de este estudio fue estimar las frecuencias alélicas y genotípicas y parámetros poblacionales de los polimorfismos identificados de los genes Beta-lactoglobulina (β-LG) y Kappa-caseína (κ-CSN3) en 14 subpoblaciones caprinas del departamento de Antioquia, Colombia. Se genotipificaron 596 y 501 animales para β-LG y κ-CSN3, respectivamente. Los genotipos AA, AB y BB para ambos genes fueron identificados mediante la técnica PCR-RFLP. Las frecuencias alélicas promedio para la β-LG A y B fueron 0,63 y 0,37 y para la κ-CSN3 fueron 0,84 y 0,16, respectivamente.
Las frecuencias genotípicas para el total de la población para β-LG fueron: 0,35 (AA), 0,57 (AB) y 0,08 (BB) y para κ-CSN3: 0,68 (AA) y 0,32 (AB); el genotipo BB no se observó en ninguna de las muestras analizadas. Para ambos loci, la población total no se encontró en equilibrio Hardy-Weinberg.
Palabras Clave: frecuencias alélicas, frecuencias genotípicas, leche, estructura poblacional, SNP
The objective of this study was to estimate the genotypic and allelic frequencies and population parameters of the polymorphisms of the beta-lactoglobulin (β-LG) and kappa-casein (κ-CSN3) genes of 14 subpopulations of goats in Antioquia, Colombia. Five-hundred and ninety-six and 501 blood samples were genotyped for β-LG and κ-CSN3, respectively. The AA, AB and BB genotypes for both genes were identified by PCR-RFLP.
The average allelic frequencies for β-LG A and B were 0.63 and 0.37 and for κ-CSN3 were 0.84 and 0.16, respectively. The genotypic frequencies for the total population for β-LG were: 0.35 (AA), 0.57 (AB) and 0.08 (BB) and the κ-CSN3 locus: 0.68 (AA) and 0.32 (AB); the BB genotype was not observed in any of the samples analyzed. For both loci, the total population was found not to be in Hardy-Weinberg equilibrium
Key words: allelic frequencies, genotypic frequencies, milk, population structure, SNP
Uno de los componentes importantes en la industria láctea es la proteína, donde 80% corresponde a las caseínas. El 20% restante corresponde a dos principales proteínas del suero, α-lactoalbúmina y β-lactoglobulina. La kappa-caseína (κ-CSN3) se diferencia de las demás caseínas por presentar una menor proporción de grupos fosfato asociados y una baja tendencia a precipitar en presencia de iones de calcio (Ca++), cualidad importante para la formación y estabilización de las micelas en la transformación de los lácteos (Alarcón 2007). Estudios recientes describen hasta 16 variantes alélicas del gen que codifica para la κ-caseína, 13 de las cuales tienen expresión fenotípica (Caravaca et al 2009). De las variantes encontradas, la A y la B son las más frecuentes en caprinos y se han encontrado asociadas con parámetros de producción y composición de la leche (Yahyaoui et al 2003).
Se ha encontrado un efecto codominante de los genotipos AA, AB y BB, donde la presencia del alelo B está asociado con un mayor porcentaje de proteína (%P) y de caseínas (Caravaca et al 2009). La β-lactoglobulina (β-LG) es la proteína sérica más abundante en la leche de los rumiantes (Aranguren-Méndez y Rojas 2008) y se encuentra en la posición 11q28 (Folch et al 1996). Se han detectado 15 variantes alélicas, pero al igual que en el gen de la κ-CSN3 las variantes alélicas de mayor frecuencia y que han sido asociadas con datos productivos son A y B (Ballester et al 2005). El genotipo AA se ha encontrado asociado con mayor producción de leche y el alelo B, tiene efecto sobre las características fisicoquímicas de la leche, contenidos de proteína y propiedades para la elaboración de queso (Aranguren-Méndez y Rojas 2008).
El objetivo de este estudio fue estimar las frecuencias alélicas y genotípicas, y parámetros poblacionales de los polimorfismos de los genes β-lactoglobulina y κ-caseína.
Se genotipificaron 596 y 501 animales para β-LG y κ-CSN3, respectivamente, pertenecientes a 14 apriscos de diferentes municipios del departamento de Antioquia, Colombia. Las cabras no pertenecian a razas puras y presentaban en su fenotipo semejanzas a las razas Saanen, Alpina, La Mancha, Toggenburg y Nubia. La extracción del DNA se realizó a partir de 2 ml de sangre tomados de la vena yugular, utilizando el método SaltingOut descrito por Miller et al (1988). Se verificó la calidad de la extracción del DNA en geles de agarosa al 2% teñidos con bromuro de Etidio, y posteriormente se cuantificó el DNA en un NanoDrop 2000 y dependiendo de su concentración, las muestras se diluyeron con buffer TE a pH de 8.0 llevándolas a una concentración final de 50 ng/μl.
La amplificación de la secuencia objetivo se efectuó en un termociclador Biorad C 1000. Para β-LG se realizó la genotipificación por la técnica PCR-RFLP. La PCR se llevó a cabo con una mezcla de reacción total de 16μl, contenida por: 1X de taq buffer KCl, 112μM de dNTP`s, 1.87μM de MgCl2, 0.5μM de la combinación de los primers F: 5´CGG GAG CCT TGG CCC CTC TGG 3´ y R: 5´CCT TTG TCG AGT TTG GGT GT 3´ reportados por Kumar et al (2006), 2 unidades de Taq DNA polimerasa y 100 ng de DNA.
El protocolo de amplificación utilizado inició con un ciclo de 95°C por 5 minutos, una segunda fase comprendida por 35 ciclos de los pasos de desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, alineamiento a 65°C por 1 min, extensión a 72°C por 90 segundos y una extensión final a 72°C por 15 min (Kumar et al 2006). La digestión de los amplificados se realizó utilizando la enzima Sac II de (Fermentas), durante 3 horas a 37 °C. La lectura de los genotipos al igual que la verificación de los amplificados se hizo en geles de agarosa de bajo punto de fusión al 2%, teñidos con bromuro de etidio.
Para K-CSN3 se realizó la genotipificación por la técnica PCR-RFLP. La mezcla de reacción total fue de 15 μl: 1X de taq buffer KCl, 200μM de dNTPs, 1,5μM de MgCl2, 0,4μM de la combinación de los primers F: 5´TCC CAA TGT TGT ACT TTC TTA ACA TC 3´ y R: 5´GCG TTG TCC TCT TTG ATG TCT CCT TAG 3´, alineados por Clustal W, 1.85 unidades de Taq DNA polimerasa y 125 ng de DNA.
El protocolo de amplificación utilizado fue un ciclo inicial de 95°C por 3 minutos, una segunda fase comprendida por 32 ciclos de los pasos desnaturalización a 95°C durante 30 segundos, alineamiento a 56,9°C por 1 minuto, extensión a 72°C por 90 segundos y una extensión final a 72°C por 10 minutos. La digestión de los amplificados se realizó utilizando la enzima HaeIII Fast Digest de (Fermentas), durante 20 minutos a 37 °C. La lectura de los genotipos al igual que la verificación de los amplificados se hizo en geles de agarosa a bajo punto de fusión al 2%, teñidos con bromuro de etidio.
El cálculo de las frecuencias genotípicas se hizo por conteo directo, mientras que las frecuencias alélicas, la heterocigosis observada (Ho), heterocigosis esperada (He) y el equilibrio Hardy-Weinberg (EHW) se calcularon utilizando el programa TFPGA versión 1.3 (Miller 1997). La estimación de parámetros poblacionales, el desequilibrio de ligamiento entre los dos loci y el análisis de varianza molecular (Amova) para cada subpoblación se realizaron en el programa Arlequin 301 (Excoffier et al 2005). Los análisis estadísticos fueron realizados para los 14 apriscos (subpoblaciones) y para la población total. Para el análisis de desequilibrio de ligamiento y equilibrio de Hardy-Weinberg se utilizaron cadenas de Markov de un tamaño de 100.000 y 10.000 permutaciones, respectivamente, con una significancia del 0.05 para cada locus.
Mediante la técnica PCR se amplificó un fragmento de 427 pb para β-LG y se identificaron los genotipos AA (427pb), AB (427/349/78pb) y BB (349/78 pb) con frecuencias de 0.35, 0.57 y 0.08, respectivamente (Figura 1). El alelo A fue el de mayor frecuencia al igual que el genotipo AA en la mayoría de los apriscos. Se observó desviación del EHW (p<0.05) en cuatro subpoblaciones y en el total de la población caprina de Antioquia (Tabla 1).
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Figura 1.
Electroforesis de la genotipificación por PCR-RFLP con la enzima SacII del gen β-LG caprina. |
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Tabla 1. Frecuencias alélicas y genotípicas, heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) y equilibrio Hardy-Weinberg (EHW) del locus β -Lactoglobulina en 14 subpoblaciones caprinas del departamento de Antioquia, Colombia. |
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Subpoblación |
N |
FRECUENCIAS |
He |
EHW (Valor de P) |
||||
|
Alélicas |
Genotípicas |
|||||||
|
A |
B |
AA |
AB1 |
BB |
||||
|
LAB |
96 |
0.58 |
0.42 |
0.35 |
0.46 |
0.19 |
0.49 |
0.67ns |
|
BIO |
28 |
0.55 |
0.45 |
0.25 |
0.60 |
0.15 |
0.52 |
0.44 ns |
|
HAT |
44 |
0.61 |
0.39 |
0.32 |
0.59 |
0.09 |
0.49 |
0.20 ns |
|
LCA |
91 |
0.77 |
0.23 |
0.56 |
0.42 |
0.02 |
0.36 |
0.14 ns |
|
SEN |
40 |
0.89 |
0.11 |
0.78 |
0.22 |
0.00 |
0.20 |
1.00 ns |
|
AQU |
80 |
0.60 |
0.4 |
0.26 |
0.67 |
0.06 |
0.48 |
<0.01* |
|
GUY |
49 |
0.54 |
0.46 |
0.08 |
0.92 |
0.00 |
0.50 |
<0.01* |
|
COR |
73 |
0.50 |
0.50 |
0.20 |
0.56 |
0.20 |
0.51 |
0.35 ns |
|
POR |
18 |
0.50 |
0.50 |
0.11 |
0.78 |
0.11 |
0.54 |
0.05* |
|
LMA |
20 |
0.58 |
0.42 |
0.20 |
0.75 |
0.05 |
0.50 |
0.06 ns |
|
UNA |
11 |
0.73 |
0.27 |
0.45 |
0.55 |
0.00 |
0.42 |
0.50 ns |
|
SFC |
10 |
0.55 |
0.45 |
0.1 |
0.90 |
0.00 |
0.52 |
0.05* |
|
TGR |
27 |
0.76 |
0.24 |
0.52 |
0.48 |
0.00 |
0.40 |
0.28 ns |
|
LVI |
9 |
0.78 |
0.22 |
0.55 |
0.44 |
0.00 |
0.45 |
1.00 ns |
|
TOTAL |
596 |
0.63 |
0.37 |
0.35 |
0.57 |
0.08 |
0.47 |
<0.01* |
|
1= Ho, ns=equilibrio HW y *=desviación del equilibrio HW |
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Se amplificó un fragmento de 645 pb para κ-CSN3 y se identificaron los genotipos AA (416/229 pb) y AB (645/416/229 pb) con frecuencias de 0.684 y 0.316, respectivamente (Figura 2). El genotipo BB no se visualizó en ninguna de las muestras analizadas. Se observó desviación del EHW (p<0.05) en una subpoblación de las 14 estudiadas (Tabla 2).
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Figura 2. Electroforesis del gen κ-CSN3 caprina (GeneRuler™ de 50-1000 bp DNA de Fermentas®). PCR-RFLP con la enzima Hae III. Laboratorio de Genética Animal, Grupo GaMMA Universidad de Antioquia, Colombia. |
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Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas, heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) y equilibrio Hardy-Weinberg (EHW) del locus κ-CSN3 en 14 subpoblaciones caprinas del departamento de Antioquia, Colombia. |
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Subpoblación |
N |
FRECUENCIAS |
He |
EHW (Valor de P) |
||||
|
Alélicas |
Genotípicas |
|||||||
|
A |
B |
AA |
AB1 |
BB |
||||
|
LAB |
58 |
0.91 |
0.09 |
0.83 |
0.17 |
0 |
0.17 |
1.00 ns |
|
BIO |
21 |
0.89 |
0.11 |
0.62 |
0.38 |
0 |
0.32 |
1.00 ns |
|
HAT |
44 |
0.91 |
0.09 |
0.82 |
0.18 |
0 |
0.19 |
1.00 ns |
|
LCA |
66 |
0.77 |
0.23 |
0.53 |
0.47 |
0 |
0.37 |
0.01* |
|
SEN |
34 |
0.79 |
0.21 |
0.59 |
0.41 |
0 |
0.36 |
0.30 ns |
|
AQU |
76 |
0.89 |
0.11 |
0.79 |
0.21 |
0 |
0.19 |
1.00 ns |
|
GUY |
45 |
0.84 |
0.16 |
0.69 |
0.31 |
0 |
0.28 |
0.57 ns |
|
COR |
70 |
0.85 |
0.15 |
0.7 |
0.31 |
0 |
0.28 |
0.20 ns |
|
POR |
16 |
0.72 |
0.28 |
0.44 |
0.56 |
0 |
0.42 |
0.25 ns |
|
LMA |
15 |
0.67 |
0.33 |
0.33 |
0.67 |
0 |
0.46 |
0.11 ns |
|
UNA |
11 |
0.95 |
0.05 |
0.91 |
0.09 |
0 |
0.18 |
1.00 ns |
|
SFC |
10 |
0.85 |
0.15 |
0.7 |
0.3 |
0 |
0.27 |
1.00 ns |
|
TGR |
26 |
0.75 |
0.25 |
0.5 |
0.5 |
0 |
0.41 |
0.28 ns |
|
LVI |
9 |
0.94 |
0.06 |
0.89 |
0.11 |
0 |
0.22 |
1.00 ns |
|
TOTAL |
501 |
0.84 |
0.16 |
0.68 |
0.32 |
0.00 |
0.27 |
<0.01* |
|
1= Ho, ns =equilibrio HW y *=desviación del equilibrio HW |
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Los resultados encontrados para los dos loci (β-LG y κ-CSN3), donde el alelo A fue mayor, son similares a los encontrados en otras razas caprinas de la India (Kumar et al 2006). El-Hanafy et al (2010) encontraron que en la raza Barki, el genotipo AB presentó la más alta frecuencia al igual que en la mayoría de la población en estudio. Los resultados encontrados para κ-CSN3 coinciden con lo reportado para las razas Barbari, Marwari, Beetal y Surti, que mostraron una mayor frecuencia del alelo A. En el caso de la raza Surti, no se encontró el genotipo BB (Caravaca et al 2009, Kumar et al 2009).
La única subpoblación que se encontró en desequilibrio de ligamiento fue la población del COR. Estos parámetros poblacionales describen el comportamiento genético de las poblaciones caprinas antioqueñas y permiten analizar y discutir la composición y frecuencia de estos loci en esta población durante la generación actual y suponer de esta manera cuales han sido los cambios con respecto a las generaciones precedentes; asimismo, inferir de los resultados obtenidos, como los diferentes sistemas de selección y manejo impartidos en los diferentes apriscos tienen una influencia directa en la frecuencia y expresión de estos loci y en la selección indirecta de otros genes que intervienen en la expresión de las características a seleccionar en un aprisco lechero.
Siendo el genotipo BB, para ambos genes, el favorable para la producción de derivados lácteos y el de menor frecuencia en la población evaluada, se infiere baja selección de características de industrialización; aunque con la alta frecuencia que se presentó del genotipo AB para β-LG y media para κ-CSN3, podría encaminarse aún con facilidad la producción hacia este objetivo. La alta frecuencia de heterocigotos posiblemente sea producto de la utilización de reproductores machos provenientes de apriscos diferentes, los cuales posiblemente tuvieron un componente genético diferente al aprisco donde se les utilizaba. Además, la falta de registros genealógicos y reproductivos en la producción caprina hace que no se tenga una información clara y pertinente de la ascendencia de los animales, con lo cual, la selección era basada principalmente por las características fenotípicas de los machos y hembras. Todo esto hace que en estas poblaciones el cruzamiento entre animales de diferentes apriscos genere mucho mestizaje y como consecuencia la heterocigosidad sea muy alta, afectando el equilibrio poblacional para ambos genes en las generaciones evaluadas en este estudio.
La baja frecuencia de genotipos BB de β-LG y κ-CSN3 asociados con un mayor rendimiento de derivados lácteos, muestra la necesidad de incluir en los criterios de selección de reproductores, la presencia del alelo B de estos dos genes en la población caprina de Antioquia.
Este artículo es parte del proyecto “Consolidación del sistema de registro genealógico y control lechero en cabras de Antioquia, para evaluación genética y montaje de programas de mejora genética” financiado por el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, La Asociación de Caprinovinocultores de Antioquia (ASOCABRA) y la Universidad de Antioquia, Código MADR: 2008Q7542. Los autores agradecen a los productores y a los estudiantes del grupo GaMMA de la Universidad de Antioquia que participaron durante la realización de este proyecto.
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Received 15 November 2011; Accepted 5 June 2012; Published 1 July 2012
