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El objetivo de este trabajo fue medir la frecuencia de excreción de material genético del virus del PRRS en semen y determinar su efecto sobre algunas características seminales. Se seleccionaron 16 verracos seropositivos a PRRS de 7 granjas porcinas de Yucatán, México, los cuales fueron muestreados durante un periodo de 6 meses con intervalos de 14 días. Para la detección del material del virus del PRRS en semen se utilizó la prueba de RT-nPCR.
El 50% (8/16) de los verracos excretaron al menos una vez material viral. De los 8 animales que excretaron, 7 lo hicieron en una ocasión y uno en dos ocasiones. Con respecto a los eyaculados (n=175) el 5.14% fueron positivos. No se encontraron diferencias entre los eyaculados positivos y negativos a PRRS con respecto a las características seminales. La alta proporción de verracos que excretaron al menos una vez material genético viral implica que el verraco podría jugar papel importante en la transmisión y persistencia de la enfermedad dentro y entre granjas. Por otro lado, la baja frecuencia de eyaculados positivos sugiere la posibilidad del uso de eyaculados negativos de animales seropositivos económicamente o genéticamente valiosos.
Palabras claves: características del semen, cerdos, PRRS, trópico
The objective of this study was to measure the frequency of shedding the PRRS virus in semen and to determine its effect on some semen traits. Sixteen seropositive boars from 7 pig farms of Yucatan, Mexico, ejaculated during 6 months, at 14 days interval were used. To detect the PRRS virus in semen the RT-nPCR test was used.
Fifty percent (8/16) boars shed at least once viral material. Of the 8 boars that shed the virus 7 did it once and one did it twice. With respect to the ejaculates (n=175) 5.14% were positive. There were no differences between positive and negative ejaculates on semen traits. The high proportion of boars shedding at least once the genetic material implies that the boars could play an important role in the transmission and persistency of the disease within and between farms. On the other hand, the low frequency of positive ejaculates suggests the possibility of the use of negative ejaculates from seropositive animals of economic o genetic value.
Key words: pigs, PRRS, semen traits, tropics
El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS) es reconocido como una de las principales enfermedades que causa grandes pérdidas económicas a la industria porcina en el mundo (Zimmerman 1991). Esta enfermedad es ocasionada por un virus denominado Lelystad aislado por primera vez en Holanda (Wensvoort et al 1991). En 1992 se aisló en Estados Unidos de América, donde el virus recibió el nombre de ATTC VR-2332 (Collins et al 1992).
El virus del PRRS es altamente infeccioso, ya que se requieren pocas partículas virales para infectar a un animal: sin embargo, es poco contagioso (Zimmerman 2003). Es un virus poco resistente al ambiente y la forma más común de transmisión es por contacto directo (Bierk 2001). La enfermedad presenta diferentes cuadros clínicos en sinergismo con otros virus, bacterias y micoplasmas y afecta a cerdos de todas las edades (Dee y Joo 1997; Pejsak et al 1997). El gran impacto económico en la producción porcina se caracteriza, en reproductoras, por el aumento del porcentaje de repeticiones debido a la muerte embrionaria temprana que produce la enfermedad, abortos tardíos, disminución de la fertilidad y del tamaño de camada, incremento de momias, nacidos muertos, débiles y mortalidad de lechones durante la lactancia (Pejsak et al 1997). Los verracos infectados con el virus del PRRS, durante la fase aguda, presentan fiebre, anorexia, letargia, signos respiratorios y disminución de libido.
La diseminación del virus por semen ocupa el segundo lugar de transmisión de la enfermedad (Le Potier et al 1997). La excreción vía semen después del desafío se ha observado a partir de los 2 a los 100 días post infección, sin presentar signos clínicos ni seroconversión (Wills et al 2003). Posterior a este periodo la excreción es intermitente (Chistopher-Hennings et al 1995; Shin et al 1997; Dee 1998). La excreción del virus disminuye después de que se desarrollan anticuerpos neutralizantes y de que desaparece la viremia. En los verracos el virus se replica dentro del tracto reproductor principalmente en el epidídimo (Shin et al 1998, Prieto et al 2003). Otros investigadores (Chistopher-Hennings et al 2001) utilizando verracos positivos vasectomizados encontraron material genético viral en eyaculados, lo que sugiere que también puede llegar mediante la sangre periférica a través de monocitos y macrófagos infectados. Jordan et al (2010) en un estudio sección cruzada notifican una prevalencia de 10.1% en semen lo cual comprueba la presencia de partículas virales en semen. Sin embargo, falta por estudiar la frecuencia a través del tiempo y persistencia de excreción del virus en semen, lo cual permitiría establecer programas de control y prevención más apropiados. Por otro lado, no existe un consenso sobre el efecto de la presencia del virus sobre la calidad del semen (Shin et al 1997; Prieto et al 2003). Algunos estudios han encontrado una reducción en la motilidad y concentración espermática al inicio de la infección (Prieto et al 1996).
El objetivo de este estudio fue estimar la frecuencia de eliminación del virus del PRRS en semen de verracos seropositivos, así como determinar el efecto sobre algunas características seminales del verraco.
El estudio se realizó en 7 granjas porcinas localizadas en la zona centro del estado de Yucatán, México, con coordenadas 19° 30’ y 21° 35’ latitud norte y 87° 30’ y 90° 24’ longitud oeste. El clima de la región es tropical subhúmedo con lluvias en verano, con promedio de precipitación pluvial anual de 997 mm (rango 700-2000 mm), temperatura media de 26.5°C (rango 7 - 42°C), y humedad relativa entre 61 y 87% (INEGI 2004).
Se utilizaron 16 verracos previamente determinados como positivos a la prueba de ELISA (Rovelo et al 2010). El punto de corte, sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA fueron: S/P ≥ 0.40, 99.9% y 99.5%, respectivamente (Polson et al 2003). Se realizó un estudio longitudinal prospectivo, donde los animales se seleccionaron por conveniencia. Once verracos permanecieron todo el periodo de estudio, y los otros cinco se desecharon por razones diversas faltándoles de 1 a 5 eyaculados para finalizar el estudio; por tanto, cada verraco eyaculó de 7 a 12 veces cada 14 días por 6 meses (6 diciembre 2005 al 4 Julio 2006). También se obtuvo información de la motilidad y porcentaje de anormalidades de los espermatozoides en semen de los eyaculados de los verracos.
Las muestras consistieron de 10 ml de semen por eyaculado/verraco, recolectándose en tubos vacutainer estériles previamente identificados y transportados en neveras con refrigerante, hasta el laboratorio de la unidad de diagnóstico de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Autónoma de Yucatán.
Para la obtención del paquete celular de semen, las muestras se colocaron en tubos previamente identificados y centrifugados a 4500 g durante 20 minutos a 25°C. Las células espermáticas se almacenaron en volumen 1:1 con PBS pH 7.3 estéril. El volumen total se separó en alícuotas: una alícuota fue almacenada en refrigeración y las restantes a -70°C.
Los iniciadores utilizados para la replicación del ARN viral de la cepa Americana” ORF7” fueron: 5’ TCG TGT TGG GTG GCA GAA AAGC 3’ y 5’ GCC ATT CAC CAC ACA TTC TTCC 3’. Para la extracción viral se utilizó un kit comercial (Quiagen QIA amp® viral RNA Mini Kit Handbook, France), según instrucciones del fabricante. Una vez obtenido el RNA se realizó la prueba de transcripción reversa de la reacción en cadena de la polimerasa (RT-nPCR) para obtener DNA viral utilizando un kit comercial (Quiagen® One Step RT-PCR Kit Handbook y Hot star Taq DNA Polimerase. France) según indicaciones del fabricante. Los iniciadores utilizados fueron: 5’ CCA GAT GCT GGG TAA GAT CATC 3’ y 5’ CAG TGT AAC TTA TCC TCC CTGA 3’. La visualización de los productos amplificados se realizó por electroforesis utilizando gel de agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio, y el resultado se observó mediante un transluminador UV.
El semen se recolectó mediante la técnica de mano enguantada. El volumen de semen se midió mediante una balanza análoga y el porcentaje de espermatozoides vivos mediante el conteo en frotis teñidos con eosina y azul de metileno. Para medir la concentración espermática se tomó una muestra de 0.1 ml de semen en 9.9 ml de una solución buffer de citrato de sodio al 3.6%, la cual una vez mezclada se tomó la cantidad suficiente para llenar la cámara de Neubauer, dejándola reposar por 5 minutos. La cantidad de espermatozoides se contó en cinco cuadros grandes de ambos lados de la cámara utilizando un microscopio con objetivo de 100X y se aplicó la fórmula para conocer la concentración por ml (Almond et al 1994). Una muestra de 1 ml de semen se conservó en formol al 10% para observar la morfología usando un microscopio de contraste de fases (100X). Las anormalidades espermáticas observadas fueron en las cabezas y colas, y la presencia de gotas citoplasmáticas.
La frecuencia de verracos que eliminaron material genético del virus del PRRS en semen se cálculo como el número de animales que eliminaron al menos una vez el virus entre el total de sementales. La frecuencia de excreción del virus en eyaculados de semen se calculó dividiendo el número de eyaculados positivos entre el total de eyaculados. Las características seminales de los eyaculados positivos se compararon con las características seminales de los eyaculados contemporáneos de los sementales negativos, mediante pruebas de t de Student (McClave et al 2006).
Ocho de los 16 verracos (50%) del estudio excretaron el virus del PRRS una sola vez y uno lo hizo dos veces durante el periodo de estudio. La excreción del virus se observó desde el primer hasta el último muestreo de los verracos, un verraco por muestreo (excepto en los muestreos 5, 7 y 10). La frecuencia de excreción del virus del PRRS en semen durante el periodo de estudio fue 5.14% (9/175).
La frecuencia relativamente alta de verracos con al menos un eyaculado contaminado con el virus del PRRS encontrada en este estudio (8/16), indica que existe excreción de material genético viral en semen de animales seropositivos. Otros estudios señalan la excreción viral por semen en animales previamente expuestos al virus de campo, infectados experimentalmente o vacunados (Chistopher-Hennings et al 1995; Shin et al 1997; Wills et al 2003). Sólo uno de los sementales estudiados eliminó el virus dos veces, lo que indica que la persistencia de excreción viral es baja; lo que pudiera deberse a la habilidad del virus de evadir el sistema inmunológico y no a la edad o al momento de infección (Allende et al 2000; Chang et al 2002). Con respecto a los animales negativos esto pudiera atribuirse a que el momento de infección no se conocía al inicio del estudio debido a que el criterio de inclusión fue solamente la seropositividad de los animales. Según Albina (1997) la infección dura aproximadamente 6 meses, y el periodo de excreción del virus vía semen es de 10 a 92 días post infección (Chistopher-Hennings et al 1995). Otro factor que pudo haber influido en la no detección del virus y su baja persistencia fue la frecuencia del muestreo ya que los sementales pudieron haber eliminado entre muestreos (cada 14 días). La persistencia y variabilidad en la excreción detectada en este estudio pudiera deberse a que no todos los animales en la granja se infectan al mismo tiempo, lo que prolonga la diseminación viral; asimismo, la duración de anticuerpos tiende a bajar después de seis meses, lo que significa que los animales se pueden re-infectar manteniéndose el ciclo infectivo (Albina 1997; Wills et al 2003).
La alta frecuencia de sementales positivos representa un riesgo para la diseminación del virus dentro de las granjas porcinas, ya que si estos animales son utilizados en monta natural podrían infectar entre 25 y 30 hembras mientras que con el uso de IA esta relación se incrementa significativamente. Según Le Potier et al (1997) el semen es el segundo medio más importante de diseminación de la enfermedad (PRRS). Como resultado de esto se podrían incrementar los brotes de la enfermedad dentro de las granjas, el rompimiento de la estabilidad enzoótica dentro de ellas y la persistencia del virus en las granjas. De igual forma se incrementa el riesgo de diseminación entre granjas de una región debido a las prácticas de manejo existentes dentro de la industria porcina.
La información generada en este estudio muestra que 9 de cada 175 eyaculados estarían contaminados con el virus del PRRS lo que pudiera considerarse un riesgo bajo de diseminación viral por este medio durante la vida productiva del semental. Sin embargo, cuando la vida productiva del animal en la granja se extiende, se aumenta la probabilidad de persistencia y diseminación del virus dentro de las granjas. Con respecto a la excreción del virus en semen varios factores pueden alterar hipotéticamente los patrones de excreción y persistencia entre ellos está: la inmunidad a exposiciones previas, diferencia entre cepas virales, edad del cerdo al momento de la infección, co-infecciones, dieta y factores genéticos (Zimmerman 2003). Feitsma (2006) en Holanda reporta que la excreción en semen es esporádica y baja. Esto puede deberse a que el virus se aloja en las glándulas accesorias del aparato reproductor y se multiplica en las células germinales del epidídimo (Prieto y Castro 2005). Otra práctica que ha favorecido la diseminación del virus es que los criterios para determinar el uso de sementales se basa en la calidad del eyaculado. Feitsma et al (1992) señala que sólo el 25% de animales infectados presentaron signos clínicos. Sin embargo, esta intermitencia en la excreción viral en semen permitiría utilizar animales infectados de alto valor genético en el momento que no están eliminando el virus. Esto se lograría a través de la prueba de RT-nPCR que podría certificar que el eyaculado se encuentra libre del virus. Además, la baja frecuencia observada en los eyaculados pudiera deberse a que las condiciones ambientales de las granja (principalmente las altas temperaturas), donde se realizó el estudio, no favorecen la sobrevivencia del virus fuera del huésped. Otro factor que pudo influir en la frecuencia es la práctica actual del uso de auto-remplazos que disminuye la circulación viral y la presencia de otras variantes del virus.
A pesar de que los verracos eran seropositivos al PRRS y que la mitad de ellos eliminó el virus o partículas virales en semen, las características seminales no se vieron afectadas. Los promedios de las características seminales aquí estudiadas están dentro de rango de valores notificados en la literatura. Algunos investigadores en México notifican valores de volumen de eyaculado de 105 a 278 ml, motilidades progresivas de 80.8 a 90%, concentración de espermatozoides/ml de 241 a 706 x 106, y concentraciones totales de 31 a 116 x 109 (Conejo 1995). Diferencias en los valores de las características seminales entre estudios pudieran atribuirse a factores como la época del año, frecuencia de eyaculación, edad de los animales, entre otros (Chistopher-Hennings et al 1997; Levis 1997).
No se encontraron diferencias entre las características seminales de los eyaculados positivos y negativos; sin embargo, se observó en los sementales que eliminaron RNA viral una disminución en la concentración espermática, un aumento de espermatozoides muertos y un incremento de gotas citoplasmáticas (Cuadro 1).
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Cuadro 1. Comparación de características seminales de sementales que eliminaron o no eliminaron el virus de PRRS. |
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Variable |
No eliminaron |
Eliminaron |
Valor de P |
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Volumen (ml) |
274 |
318 |
0.309 |
|
Concentración (x109) |
98.3 |
64.3 |
0.152 |
|
Motilidad (%) |
72.71 |
74.4 |
0.852 |
|
Muertos (%) |
13.3 |
15.4 |
0.154 |
|
Células vivas (%) |
80.3 |
84.6 |
0.511 |
|
Células normales (%) |
75.9 |
72.6 |
0.784 |
|
Gota (%) |
14.4 |
17.3 |
0.746 |
|
Anormalidades en colas (%) |
3.01 |
3.86 |
0.273 |
|
Anormalidades en cabezas (%) |
1.01 |
1.29 |
0.647 |
|
Acrosomas anormales (%) |
2.64 |
5.71 |
0.528 |
La razón de que no se haya encontrado diferencias significativas entre las características seminales aquí estudiadas, pudiera deberse a que no se conocía el momento de la viremia, que es el momento cuando se pueden presentar efectos negativos sobre las características seminales (Chistopher-Hennings et al 1997; Prieto y Castro 2005). Otros estudios mencionan que los efectos negativos ocurren entre la segunda y decima semana post-infección reduciéndose la motilidad y concentración espermática, y aumentando la presencia de defectos en cabezas y acrosomas (Prieto et al 1996; Chistopher-Hennings et al 1997).
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Received 20 September 2012; Accepted 22 September 2012; Published 1 October 2012