Comparison of methods for extracting DNA in guinea pigs (Cavia porcellus Rodentia, Caviidae)

En estudios de genética molecular es imprescindible contar con ADN de alta calidad para llevar a cabo las diferentes técnicas de laboratorio. El tejido más utilizado para la obtención de ADN es la sangre. Sin embargo en algunas ocasiones la toma de este tipo de muestras es de gran dificultad. La utilización de pelo y en especial de su folículo piloso, como tejido para la extracción de ADN, es una excelente alternativa de muestreo que posee múltiples ventajas frente a la colección de sangre. En este trabajo se presenta un protocolo para la extracción de ADN a partir de muestras de pelo con folículo piloso y se realizó una comparación de su eficiencia con respecto a los métodos de extracción de sangre y con Kit comercial.

Se encontraron diferencias estadísticas (p<0.05) para los valores de concentración de ADN obtenidos con los métodos de extracción a partir de pelo y la interacción entre la cantidad de pelo y el tiempo de incubación. Se encontró diferencia estadística (p<0.05) al comparar los mejores tratamientos para métodos de extracción de ADN de folículo piloso con el método de extracción a partir de sangre, donde este ultimo presentó las mayores concentraciones. El método de fenol cloroformo con las modificaciones descritas en este trabajo, es un procedimiento de extracción de ADN no invasivo y de alta confiabilidad.

Palabras clave: genética molecular, marcadores moleculares, microsatélites, roedores

Comparison of methods for extracting DNA in guinea pigs (Cavia porcellus Rodentia, Caviidae)

Abstract

In studies of molecular genetics is indispensable to obtain high quality DNA to carry out the different techniques of laboratory. The blood tissue has been the most used to obtain DNA. Nevertheless obtaining this type of samples is of great difficulty some times. The use of hair and especially hair follicle for DNA extraction tissue is an excellent sampling alternative, because has many advantages over blood tissue collection. In this work, a hair follicle sample DNA extraction protocol is provided and a comparison with blood DNA extraction and commercial kit DNA extraction is made.

Statistical differences (p<0.05) for the DNA concentration values obtained from hair extraction methods and the quantity of hair and time of incubation interaction were found. Comparing the best treatments for hair DNA extraction methods with blood DNA extraction method, statistical differences (p<0.05) was found, where blood DNA extraction method present the major concentrations. The phenol-chloroform DNA extraction method from hair samples with the modifications described in this work is a no-invasive and high reliability procedure.

Introducción

Los estudios de poblaciones mediante las herramientas de la biología molecular, han generado importantes avances de los diferentes sistemas de producción pecuarios, ya que permiten determinar el grado de variabilidad genética presente en una población, y por ende diseñar estrategias que permitan realizar un mejoramiento genético de éstas (Toro y Caballero 2005).

Las diferentes técnicas moleculares empleadas en estos estudios, requieren la obtención de ADN de alta calidad, que permita entre otros, una optima amplificación de fragmentos vía PCR, o la digestión con enzimas de restricción. Para tal fin es imprescindible contar con muestras que permitan aislar ADN en gran cantidad y calidad, siendo la sangre, el tejido por excelencia para esta labor (Smith y Burgoyne 2004). Sin embargo en múltiples ocasiones la toma de este tipo de muestras representa una gran dificultad, y en el caso de los sistemas de producción animal, la toma de muestras puede desencadenar algunas situaciones de estrés para los animales (Dolores et al 2008).

Por otro lado, en algunas especies de animales como el cuy (Cavia porcellus), la colección de muestras de sangre es difícil, puesto que esta debe realizarse por medio de punción cardiaca y podría provocar la muerte del animal si no se realiza adecuadamente. Además en esta misma especie, dadas las características de su hemograma, la coagulación de la sangre es muy rápida (Kaspareiti et al 1988, Burgos et al 2007)

Considerando las características y dificultades mencionadas, y con el fin de realizar estudios poblacionales en esta especie con información de marcadores moleculares, es necesario utilizar otros tejidos que puedan contener ADN, y que sean de fácil colección, como lo es el pelo, uñas o piel (Cervantes 2003). La utilización de pelo con folículo piloso, como tejido para la extracción de ADN, es una alternativa de muestreo que posee múltiples ventajas frente a la colección de sangre, destacándose la realización del muestreo en una mayor cantidad de individuos por unidad de tiempo y la fácil colección de muestras en individuos de temperamento fuerte. La colección de muestras de pelo es considerada como una técnica de muestreo no invasiva (Amory et al 2007).

Dentro de las desventajas que posee la toma de este tipo de muestras se encuentran, recolección de muestra dolorosa en algunos individuos, no se puede realizar en animales que carecen de suficiente cantidad de pelo (Cervantes 2003), y la baja cantidad de ADN que se obtiene (Higuchi et al 1988), especialmente de ADN nuclear por efecto de daño mecánico (Nozawa et al 1999, Linch et al 2001). A pesar de las desventajas, este tipo de muestras han sido ampliamente utilizadas en análisis moleculares que involucren STR`s y ADN mitocondrial (Amory et al 2007, Pfeiffer et al 2004), dado a los avances logrados en la optimización de protocolos para la extracción de ADN (McNevin et al 2005) y la presencia en el mercado de kits específicos para extracción de ADN.

De acuerdo a lo expuesto, el objetivo de este estudio fue evaluar la eficiencia de dos metodologías de extracción de ADN a partir de muestras de folículo pilosos de Cavia porcellus, y su comparación con la extracción de ADN a partir de muestras de sangre, además de verificar la calidad de este ADN para la tipificación con marcadores microsatélites.

Metodología

Recolección de las muestras

Se recolectaron muestras de pelo con folículo piloso y de sangre a 6 animales, provenientes de diferentes explotaciones comerciales en el departamento de Nariño, y del mercado minorista de la ciudad de Medellín, departamento de Antioquia, en Colombia. Del cuello de cada animal se tomaron 20 mg de pelo con folículo piloso y se almacenaron en bolsas de papel a temperatura ambiente. También se extrajo de 3 a 5 mL de sangre en tubos vacuntainer mediante punción cardiaca y se almacenaron a 4ºC (Burgos et al 2007). Las muestras se transportaron al laboratorio de Genética y Mejoramiento Animal de la Universidad de Antioquia, para su procesamiento.

Extracción de ADN a partir de folículo piloso

La extracción de ADN se realizó a 50, 100, 150 y 200 folículos pilosos de cada animal, previamente lavados con agua deionizada (Figura 1).

El ADN se extrajo mediante dos metodologías. La primera basada en la extracción mediante fenol-cloroformo, descrita por Sambrook y Russell (2001), con modificaciones. A cada tubo se adicionó 500 µL de buffer de digestión (10 mM tris HCl, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 2% SDS), 40 mM de ditriotreitol (DTT) y 0.3 mg/mL de proteinasa K (Invitrogen), y se incubaron durante 6, 12 y 24 horas a 56ºC. Cuando el tiempo de incubación fue superior a 6 horas, se adicionó nuevamente proteinasa K y DTT. Pasado este tiempo, las muestras se agitaron con ayuda de vortex y el sobrenadante se transfirió a un nuevo vial donde se adicionó un volumen igual de Fenol-Cloroformo-Isoamilo relación 25:24:1. Por agitación, se formó una emulsión, se centrifugó a 13000 RPM (revoluciones por minuto) durante 5 minutos a temperatura ambiente y se transfirió la fase superior acuosa a un nuevo vial. Se adicionó 400 µL de N-Butanol saturado con agua para remover el cloroformo y se centrifugó a 13000 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente y se descartó la fase superior sin desechar la inferior donde se encuentra el ADN. Posteriormente se adicionó 1/10 de volumen de acetato de sodio 2M y un volumen de etanol absoluto a -20ºC. Se realizó la mezcla por inversión de los componentes y nuevamente se centrifugó a 13000 RPM durante 5 minutos a 4 ºC y para posteriormente descartar el sobrenadante. El botón de ADN se lavó con 200 µL de etanol al 70%, se centrifugó a 13000 RPM durante dos minutos, se descartó el etanol y el tubo se dejó secar colocándolo invertido sobre una toalla de papel. El ADN se resuspendió en 50 µL de buffer TE 1X y se almacenó en una nevera a -12ºC para su posterior uso.

El segundo método consistió en la extracción de ADN con el kit DNeasy blood and tissue Qiagen, de acuerdo a las recomendaciones realizadas por la casa fabricante (Qiagen 2006).

Extracción de ADN a partir de sangre

Para las muestras de sangre, el ADN se extrajo por el micrométodo de precipitación salina Salting Out descrito por Miller et al (1998). Se tomaron 200µl de sangre total con anticoagulante EDTA llevándolos a un volumen final de 1500µl con solución A (Sucrosa 0.3M, Tris HCl 0.5M, Tritón 1X, MgCl₂ 1M) a 4ºC y mezclados por inversión. Posteriormente se centrifugó a 13000 RPM durante 3 minutos, se descartó el sobrenadante y el botón fue lavado con solución salina 0.9%. Se agregó 150 µl de solución B (NaCl 6M, EDTA 0.5M, SDS 20%, Perclorato de Sodio 5M) mezclándolos vigorosamente con vortex durante 15 segundos. Se adicionaron 50µl NaCl 6M, se mezcló con vortex durante 15 segundos y se centrifugó a 13000 RPM durante 3 minutos. El sobrenadante fue transferido a un tubo evitando remover el botón de proteínas, se adicionó 200µl de isopropanol a -20ºC y se mezcló por inversión hasta precipitar el ADN. Luego de centrifugar a 13000 RPM durante 3 minutos, se descartó el sobrenadante y se adicionaron 200µl de etanol al 70% para lavar el boton. Se descartó el etanol dejando secar el tubo colocándolo invertido sobre una toalla de papel. Se adicionaron 100µl de buffer TE 1X para resuspender el ADN y se almacenó a -12ºC hasta su uso.

Verificación de la extracción y cuantificación del ADN

Para verificar la calidad del ADN extraído, se realizó una electroforesis en geles de agarosa al 1% en TBE 0.5X (Tris 45 mM, acido bórico 45 mM, EDTA 1 mM pH 8.0) y 0,1% de bromuro de etídio, durante 30 min., a 80 Voltios. El gel se visualizó con ayuda de un transiluminador UV donde se juzgó la calidad, al determinar si no hay fragmentación o un barrido del ADN. Al mismo tiempo, las muestras se analizaron en un espectrofotómetro NanoDroop^® 1000 Thermo, a fin de establecer la concentración de ADN presente a partir de una densidad óptica de lectura de 260nm y se evaluó la relación 260/280 para verificar el exceso de proteínas (Cervantes 2003).

Amplificación vía PCR

Para evaluar la calidad del ADN extraído se llevó a cabo la amplificación del microsatélite SPS115 (Número de acceso Genbank FJ828565) incluido en la lista de la International Society of Animal Genetics-ISAG. Se emplearon muestras de ADN extraídas por las diferentes metodologías y como testigo se utilizó una muestra de ADN bovino. Las condiciones de reacción y temperaturas se encuentran descritas por Martínez et al (2009). La amplificación de los fragmentos se realizó en un termociclador Biometra. Se realizó una electroforesis en gel de Agarosa al 2% a 70 voltios durante 20 minutos. Para determinar el tamaño de los fragmentos se utilizó un marcador de peso molecular de 50 pb. Los fragmentos se visualizaron con ayuda de un transiluminador.

Análisis estadístico

Para el análisis de los datos obtenidos de concentración de ADN y la comparación entre los métodos de extracción a partir de pelo, se utilizó un modelo en parcelas subdivididas (Split-split plot), con 6 repeticiones:

Donde Y_ijkl es la cantidad de ADN obtenida; τ_i, β_j, y (τβ)_ij representan la parcela principal, y hacen referencia a la réplica (i = 1…6 animales), cantidad de pelo (j = 50, 100, 150 y 200 pelos) y el error (a) asociado a la parcela respectivamente. γ_k, (τγ)_ik, (βγ)_jk y (τβγ)_ijk, corresponden a la parcela secundaria y hacen referencia al método de extracción (j=Fenol-cloroformo, Kit) las interacciones animal por método y cantidad de pelo por método y el error (b) asociado a esta subparcela. δ_l, (δτ)_il, (βδ)_jl, (γδ)_kl, (τβδ)_ijl,(τγδ)_ikl,(βγδ)_jklestán relacionados con el efecto de tiempo de incubación (l = 6, 12, 24 horas), la interacción tiempo de incubación por replica, tiempo por cantidad de pelo, tiempo por método de extracción, replica-cantidad de pelo-tiempo, replica-método-tiempo y cantidad-método-tiempo. El factor de interacción (τβγδ)_ijkl, corresponde al error (c) asociado a la sub-subparcela.

El ajuste de las medias se realizó por el método de mínimos cuadrados y la comparación se hizo mediante la prueba de Tukey. Los análisis estadísticos se realizaron con el procedimiento GLM del paquete estadístico SAS 9.1 (SAS 2006)

Posteriormente, se comparó los mejores tratamientos para extracción de ADN por Kit y Fenol-cloroformo, con los obtenidos con la extracción a partir de sangre. El modelo experimental fue el siguiente:

Donde Y_ij es la concentración de ADN; µ es la media general; τ_i es el efecto fijo del método de extracción donde i= sangre, mejor nivel de fenol-cloroformo y mejor nivel de Kit; y e_j(i) es el error asociado a cada observación. La comparación de las medias se hizo con la prueba de Tukey.

Resultados

La electroforesis del ADN extraído y la posterior visualización, permitió determinar la efectividad de las diferentes metodologías para la obtención de ADN de las muestras de sangre y pelo en Cavia porcellus, tal como se aprecia en la Figura 2.

Considerando los métodos de extracción de ADN a partir de pelo, el análisis de varianza indicó que el método empleado para la extracción de ADN aporta diferencias estadísticas (P<0.05) en la concentración obtenida. El método de fenol cloroformo extrajo mayor cantidad de ADN respecto al Kit comercial (p<0.01). Por otro lado, se encontró influencia altamente significativa (p<0.01) para la interacción de método, tiempo y cantidad (SC= 373.5; GL= 6).

Para la interacción tiempo y cantidad, se obtuvieron concentraciones de ADN que oscilaron entre 12.1 ± 2.78 ng/µL en 6 horas y con 50 pelos, hasta 29.5 ± 6.44 ng/µL para 24 horas y 200 pelos. La mayor cantidad de ADN se obtuvo cuando las muestras se dejaron incubar 24 horas.

En la tabla 1, se presentan las concentraciones de ADN obtenidas, considerando la interacción tiempo de incubación, cantidad de pelo según el método de extracción.

Tabla 1. Cantidad de ADN extraído (ng/µL) de acuerdo el tiempo y la cantidad de pelo utilizado
Tiempo, horas	Cantidad de pelo	Método
Tiempo, horas	Cantidad de pelo	Fenol cloroformo	Kit
6	50	11.9 ± 2.43^a	12.3 ± 3.32ª
6	100	16.9± 3.63^a	12.5 ± 1.76ª
6	150	31.8 ± 6.29^c	24.1 ± 6.37^b
6	200	25.5 ± 2.78^bc	19.6 ± 3.21^ac
12	50	14.7 ± 3.07^a	18.1 ± 4.71^ac
12	100	28.6 ± 7.40^bc	20.8 ± 4.93^b
12	150	24.2 ± 4.60^b	18.6 ± 2.64ª
12	200	23.6 ± 3.78^b	24.4 ± 6.84^b
24	50	16.2 ± 1.96^a	18.1 ± 1.59ª^b
24	100	29.0 ± 9.40^c	27.1 ± 1.46^bcd
24	150	31.8 ± 3.25^c	19.5 ± 3.46ª
24	200	26.6 ± 2.94^bc	33.4 ± 6.79^d
Medias con letras diferentes en la misma columna indican diferencia estadística significativa (p<0.05)

Las concentraciones de ADN oscilaron entre 11.9 ± 2.43 y 31.8 ± 6.29 ng/µL, para fenol cloroformo, y para la extracción con Kit las concentraciones oscilaron entre 12.3 ± 3.32 y 33.4 ± 6.79 ng/µL de ADN. Las concentraciones fueron en casi todos los casos superiores para el método de fenol-cloroformo. La extracción con Kit permitió obtener mayores concentraciones de ADN cuando el número de pelos fue de 50, indiferente al tiempo de incubación.

Dos de las muestras utilizadas eran de animales de pelo rojo, y se encontró que los pelos de color rojo o amarillo intenso, dejaron el ADN extraído de color oscuro, lo que no ocurrió con pelos de color negro, además de que su completa degradación se dio entre las 6 y 12 horas de incubación.

Los mejores tratamientos para fenol cloroformo fueron 6 horas y 150 pelos, y 24 horas y 150 pelos; mientras que para la extracción con kit, el mejor tratamiento fue 24 horas y 200 pelos. Estos tratamientos fueron comparados con el método de extracción de ADN a partir de muestras de sangre, donde este último presentó diferencias estadísticas (p<0,05) con respecto a los de pelo, con una concentración media de ADN de 53.0 ± 3.48 ng/µL, y cantidades que oscilaron entre 29.8 y 95.3 ng/µL.

Con el ADN extraído de folículo piloso en los mejores tratamientos de las dos metodologías, se realizó ensayos de amplificación vía PCR del marcador microsatélite SPS115. Los resultados encontrados muestran la presencia de un fragmento de 262pb, sin embargo se encontró diferencias en la florescencia de las bandas debido principalmente a las concentraciones de ADN de las muestras (Figura 3).

Cabe resaltar que en los individuos evaluados, se encontró una banda con tamaño cercano al reportado en Búfalos (Martinez et al 2009), sin embargo, la pobre definición de la banda puede ser indicio de una amplificación inespecífica y falta de ajuste en las condiciones de amplificación por PCR para este fragmento en la especie.

Discusión

Algunos autores que han realizado estudios a nivel de genética molecular en cuyes, han indicado tejidos para la obtención de extracción de ADN, como la sangre, hígado y piel (Spotorno et al 2004, Burgos et al 2007). Sin embargo en múltiples ocasiones, la obtención de estos tejidos, implica una situación de estrés para el animal, e inclusive su muerte. Ante esta situación es necesario realizar ensayos que permitan la obtención de muestras, que no sean invasivas o perjudiciales para el animal, además debe ser considerado, que para el estudio de animales provenientes de núcleos pequeños, tales como los individuos denominados “criollos”, estos estudios buscan determinar la diversidad genética de las líneas y la posterior recomendación de estrategias de conservación. Así que la obtención de muestras no debe implicar ningún tipo de daño para estos individuos.

Los resultados de este estudio, indicaron que le extracción de ADN de sangre permitió obtener una mayor concentración de ADN, que la realizada en pelo, tal y como lo menciona Nozawa et al (1999). Sin embargo, la colección de muestras de pelo no generó la perdida de individuos y por el contrario, permitió incrementar el número de individuos muestreados.

En cuanto a la eficiencia del método de extracción de ADN de pelo, en los dos métodos se logró extraer ADN en los seis individuos analizados en cada uno de los ensayos, sin embargo el método de Fenol cloroformo con las modificaciones reportadas en este trabajo, permitió extraer una mayor cantidad de ADN respecto a la extracción de ADN por Kit. Cabe resaltar que el método de Fenol cloroformo, implica la utilización de materiales orgánicos, altamente tóxicos y contaminantes.

En los diferentes métodos se realizó la evaluación de cantidad de pelo y horas de incubación. Al respecto, Dolores et al (2008) y Pfeiffer et al (2004) mencionaron que la principal desventaja es el tiempo que requiere la extracción de ADN. En este estudio se encontró que algunas muestras, especialmente las de pelo de color claro, se degradaban de 2 a 4 h, los pelos de color amarillo a rojo se degradaron de 6 a 12 horas, y los pelos de color negro no se degradaron sino hasta después de 18 horas. Los valores de ADN encontrados (Tabla 1) indicaron que cantidades mayores a 100 pelos permitieron obtener buena cantidad de ADN, en los diferentes tiempos de incubación

Debido al tamaño del folículo y el grosor del pelo de cuy, fue necesario utilizar una gran cantidad de pelo para obtener suficiente ADN. La utilización de gran cantidad de pelo implica la posible existencia una gran cantidad de elementos, tales como melanina, que podrían convertirse en inhibidores de la PCR (Suenaga y Nakamura 2005).

Para verificar la existencia de posibles inhibidores de PCR, se realizó la amplificación vía de un fragmento microsatélite que no ha sido reportado en cuyes. Los resultados encontrados mostraron la presencia de una banda con peso molecular similar al reportado en Búfalos en los individuos analizados menos en los que presentaron el producto extraído de coloración oscura, lo que puede ser indicio de un exceso de residuos de melanina liberados en la degradación del pelo y que inhiben la acción de la Taq polimerasa en la reacción de PCR.

En consecuencia, la extracción de ADN a partir de pelo, es un procedimiento no invasivo y de alta confiabilidad, y puede ser utilizado para trabajos en el área de la genética molecular en cuyes. El método de fenol cloroformo con las modificaciones descritas en este trabajo, fue el más eficiente en cuanto a cantidad de ADN obtenida. Los resultados encontrados permiten recomendar la no utilización de muestras de pelo de color rojo debido a la presencia de inhibidores de la PCR, incurriendo así en mayores costos en reactivos y tiempo para su eliminación.

Agradecimientos

Al laboratorio de Genética y Mejoramiento Animal y al Centro de Investigaciones Agrarias de la Universidad de Antioquia. Este Proyecto fué financiado por el CODI, Universidad de Antioquia y la Fundación Universitaria San Martín)

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Comparación de métodos para la extracción de ADN en cuyes (Cavia porcellus Rodentia, caviidae)

W Burgos-Paz, M Cerón-Muñoz* y M Moreno-Ochoa**

Resumen

Comparison of methods for extracting DNA in guinea pigs (Cavia porcellus Rodentia, Caviidae)

Abstract

Introducción

Metodología

Recolección de las muestras

Extracción de ADN a partir de folículo piloso

Extracción de ADN a partir de sangre

Verificación de la extracción y cuantificación del ADN

Amplificación vía PCR

Análisis estadístico

Resultados

Discusión

Agradecimientos

Bibliografía