Caracterización genética de las razas criollas BON y Romosinuano

S J Calvo*, E Martínez*, J F Tirado*, J D Corrales*, A E Montoya*, W O Burgos*, M F Cerón-Muñoz*-** y M Moreno*-***

 *Grupo de Genética y Mejoramiento Animal, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia,

samirjulian@gmail.com

** Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia

 ^*** Instituto de Biología, Universidad de Antioquia

(Proyecto financiado por el CODI, Universidad de Antioquia)

Resumen

El objetivo de este estudio fue caracterizar genéticamente las razas criollas Bovinas BON y Romosinuano utilizando diez marcadores moleculares Microsatélites. El marcador con mayor número de alelos fue el INRA037, mientras que el marcador con menor número de alelos fue el INRA 064. Los diez marcadores microsatélites fueron polimórficos para los dos grupos raciales. Las poblaciones no se encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg, la probabilidad de exclusión (PE) y el contenido de información polimórfica (PIC) presentaron un porcentaje alto para las dos poblaciones, por lo tanto los anteriores marcadores pueden ser utilizados para pruebas de paternidad y caracterización de las dos razas.

Palabras claves: Análisis de parentesco, genética molecular, microsatélite, técnica de PCR

Genetic characterization of the native Colombia breeds: BON and Romosinuano

Abstract

The aim of this study was to characterize genetically BON and Romosinuano bovine breed, using ten Microsatellites molecular markers. The marker with the highest number of alleles was INRA037, while the marker with fewer alleles was INRA 064. The ten microsatellite markers were polymorphic for the two racial groups. Stocks show not in Hardy-Weinberg, the probability of exclusion (PE) and the information content polymorphism (PIC) they presented a high percentage for both populations; therefore the previous markers can be used for paternity testing and characterization of the two breeds.

Keywords: Microsatellite, molecular genetics, parentage analysis, PCR technique

Introducción

Las razas criollas colombianas se originaron de algunos de los ganados europeos traídos a Colombia por los conquistadores españoles. Es así como el BON y el Romosinuano proviene muy seguramente del Berrendo Andaluz y de otros Animales Europeos Antiguos (Rouse 1977).

Por mucho tiempo estas razas criollas rigieron los campos colombianos convirtiéndose en la mejor alternativa para la producción de leche y carne. Posteriormente se introdujeron razas foráneas que prometían mayor producción de leche y carne, pero que por problemas de adaptación al trópico, presentaron una disminución en los índices reproductivos y productivos en comparación con los presentados en su lugar de origen. Las razas autóctonas como el BON y el Romosinuano poseen más de 500 años de adaptación a las condiciones del trópico colombiano, confiriéndoles ventajas como la resistencia a enfermedades propias de esta zona o  la producción en condiciones climáticas extremas. Sin embargo el número de ejemplares puros que se conservan en el territorio nacional de ambas razas es bajo, siendo importante que esta única e invaluable fuente genética sea protegida, por lo que ya se está trabajando en su conservación y repoblamiento, al mismo tiempo que en su evaluación productiva como alternativa de producción pecuaria en el trópico (Asocriollo 2008).

Una de las herramientas que aporta gran información para la conservación y repoblamiento de las razas criollas, es el estudio del ADN con marcadores moleculares del tipo microsatélites, en especial sobre de la diversidad genética entre poblaciones y dentro de ellas mismas (Zamorano et al 1998). Antes del desarrollo de las técnicas moleculares, la identificación de individuos se realizaba por marcajes o señales fenotípicas características de cada animal y a la hora de asignar el linaje a un individuo, se identificaban los rasgos que fueran comunes a los individuos del linaje (Ferguson et al 1941).

En la actualidad se dispone de mas de 1200 STR en bovinos, altamente polimórficos, con herencia mendeliana simple y alelos de tipo codominante (Kappes et al 1997), debido a este gran número de STRs, la ISAG (Sociedad Internacional de Genética Animal) y la Food and Agricultura Organization (FAO) seleccionaron un grupo de microsatélites diferentes, en especies de animales domésticos como los bovinos, equinos, porcinos, caninos, ovinos y caprinos, con el fin de ser empleados para estudios de caracterización genética, identificación de individuos y en trabajos sobre diversidad genética (Bozzini et al 1996), además  permiten resolver casos de filiación con una probabilidad cercana a la unidad o resolver casos de abigeato e identificación individual (Giovambattista et al 2001)

Este estudio es una primera aproximación al conocimiento de la estructura genética de las poblaciones bovinas de ganado Blanco Orejinegro (BON) y Romosinuano en el territorio colombiano, como base para la elaboración de programas de conservación, producción, identificación y mejoramiento genético.

Materiales y métodos 

Se muestrearon 61 animales de la raza Blanco Orejinegro (BON) pertenecientes a la Hacienda Vegas de La Clara, propiedad de la Universidad de Antioquia ubicada en la vereda Vegas de la Clara en el Municipio de Gomez Plata, Antioquia, Colombia; y 60 animales de la raza Romosinuano de las Haciendas el Espejo ubicada en la región del Urabá Antioqueño, Hacienda Cardosa ubicada en el municipio de Restrepo Valle del Cauca y las Haciendas Manoa y San Luis ubicadas en Villavicencio y Pachiaquiaro, respectivamente, en el Departamento del Meta, Colombia.

En cada individuo se colectó 4 ml de sangre en tubos Vacutainer con EDTA, mediante punción en la vena coccigea y posteriormente fueron transportadas al laboratorio de Genética Animal de la Universidad de Antioquia para su procesamiento. El ADN se extrajo por el método Salting Out descrito por Miller et al (1988).

Se analizaron los marcadores microsatélite BM1824, INRA037, SPS115, BM2113, ETH225 ETH10, INRA 032, INRA064, TGLA122 y TGLA126 incluidos en la lista de la ISAG (sigla del ingles International Society of Animal Genetics), para estudios poblacionales en bovinos, ovinos y caprinos, mediante la técnica de PCR (Mullis y Faloona 1987). La localización cromosómica correspondiente y la secuencia de los cebadores se indican en la tabla 1.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 16μL, buffer de reacción 1X (10mM Tris-HCL pH 9.0; 50mM KCl; 0.1 % Triton® X-100); 1.8mM de MgCl_2; 0.2mM dNTPs, 0.2 mM de cada cebador y 1U de Taq polimerasa (Promega, AmpliTaq gold, 5U/ml) con 30ng de ADN; La amplificación se realizó en un termociclador T-Personal 48 (Biometra® GMBH, D-37079 Goettingen, Germany).

Los diez microsatélites se trabajaron en sistemas múltiplex agrupados en dos triplex T1 (ETH10, BM1824, Inra037), T2 (SPS115, Inra064, ETH225); y dos duplex D1 (Inra032, BM2113) y D2 (TGLA122, TGLA126). Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: un primer paso de 5 minutos a 95ºC seguido de 30 ciclos de amplificación (30 segundos de desnaturalización a 94ºC, 45 segundos de hibridación a 56ºC y 45 segundos de extensión a 72ºC) seguido de un único ciclo de 15 minutos de extensión final a 72ºC. Para el múltiplex D2 la temperatura de hibridación fue de 58°C. Los amplificados resultantes de la PCR se corrieron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 6% y se visualizaron por medio de tinción con nitrato de plata al 1%. El tamaño de las bandas se determinó con ayuda de un marcador de peso molecular.

Análisis estadístico

Con la información obtenida de los diferentes loci, se calculó la heterocigosidad observada (Ho) y esperada (He) (Nei 1972) para cada loci en cada población y se estableció la presencia o ausencia de equilibrio Hardy Weinberg, mediante el programa GDA, Genetic Data Analysis. (Lewis y Zaykin 2001).

Por otro lado se calculó el contenido de información polimórfico PIC (Botstein y White 1980) para cada uno de los marcadores, a fin de establecer si los marcadores seleccionados proporcionaron información suficiente para describir la variabilidad genética en la población.

También se estimó la probabilidad de exclusión (PE), tanto de forma individual, como para el conjunto de los marcadores según lo descrito por Jamieson (1994).

Resultados y discusión 

En la tabla 2 se indican las frecuencias alélicas para cada uno de los marcadores utilizados en la raza BON. La frecuencia más alta para un alelo se observó en el marcador INRA037 con 0.491 para el alelo 130, mientras que la frecuencia más baja se encontró para los alelos 260 y 163 de los marcadores SPS115 y TGLA122, respectivamente.

En general los alelos encontrados se distribuyen de manera uniforme dentro de la población para los diferentes marcadores, es decir, no se evidenció la presencia de alelos en una alta frecuencia que pudieran afectar la variabilidad genética de la población.

Al comparar el número de alelos encontrados en la raza BON para cada marcador, con los hallados en trabajos donde se utilizaron los mismos marcadores en razas criollas de ganado, (Armstrong et al 2004, Martinez et al 2005, Zamorano et al 1998), se encontró que casi todos los marcadores presentaron una mayor cantidad de alelos para el ganado BON, lo cual es indicio de la riqueza alélica presente en esta raza. Los marcadores microsatélites con mayor número de alelos fueron el INRA037 y el TGA122 con 13 y 12 alelos respectivamente, con un cantidad media de alelos en la población de 9.3 (Tabla 3).

En la mayoría de marcadores evaluados, se observó un leve desvío con respecto a las proporciones esperadas bajo el equilibrio de Hardy-Weinberg, a excepción del microsatélite SPS115, donde la heterocigosidad esperada fue igual a la observada (Tabla 3), es decir, las frecuencias alélicas para este marcador han sido estables de una generación a otra.

La información encontrada en cuanto a número de alelos y alta heterocigosidad, permiten sugerir que a pesar del bajo tamaño de la población y los diferentes mecanismos de selección y mejoramiento animal aplicado, tendientes a mejorar la producción de leche en esta raza, la población evaluada presenta una alta variabilidad genética, al mismo tiempo gran  riqueza alélica, cualidad que pueden conferirle algunas de las características que la diferencian dentro del sistema productivo.  

En cuanto al PIC o índice de contenido polimórfico, se encontraron valores superiores a 0.60, donde el valor más alto lo presentó el marcador ETH225 con 0.85 mientras que el más bajo fue de 0.618 para el marcador BM2113. El valor general de PIC para el conjunto de marcadores fue de 0.785, que de acuerdo a lo mencionado por Botstein et al (1980), se clasificarían como marcadores altamente informativos y por ende, se puede afirmar que los marcadores empleados proporcionaron información suficiente para poder determinar la variabilidad genética de la raza y constituyen la base para futuros estudios de caracterización y evaluación genética en esta raza.

El poder de discriminación de un individuo con respecto a la población mediante la probabilidad de exclusión total fue del 99.4%. Al considerar el conjunto de marcadores es posible hacer inferencias sobre los parentales de un individuo y por ende ser utilizados en pruebas de paternidad.

En la tabla 4, se describe los valores de frecuencia de los alelos encontrados en las poblaciones de ganado Romosinuano para cada marcador. Se encontraron algunas similaridades con las frecuencias de los alelos en la raza BON. El alelo 178 presente en los marcadores BM1824 y INRA064 mostró la mayor frecuencia en estas poblaciones con valores de 0.577 y 0.508 respectivamente, es decir, estos alelos constituyen el 50% de los alelos presentes en la población para éstos marcadores y puede ser que su alta frecuencia este influenciada por los procesos de selección. En los demás alelos en cada marcador se observó una distribución uniforme de sus frecuencias. 

Los marcadores con mayor cantidad de alelos observados en la raza Romosinuano fueron el INRA037 y el TGLA126 con 12 alelos para cada marcador, mientras que el marcador INRA032 fue el que presentó el menor número de alelos (Tabla 5). El número de alelos encontrado en las razas criollas BON y Romosinuano presentaron diferencias para cada marcador, sin embargo el número promedio de alelos fue muy similar, con 9.3 para BON y 9.1 para Romosinuano.

En este estudio se encontró una mayor cantidad de alelos presentes en la raza Romosinuano, que los reportados por Zamorano et al (1998) y Martínez et al (2005) con los mismos marcadores en otras razas criollas. Estos hallazgos muestran que las poblaciones criollas BON y Romosinuano, poseen una mayor riqueza alélica comparándolas con otras poblaciones de ganado bovino criollo presentes en Suramérica.

De los marcadores evaluados, el marcador BM1824 fue el único que presentó un exceso de heterocigotos, mientras que el marcador INRA037 mostró un déficit marcado de éstos. Todos los marcadores presentaron diferencias con respecto a los valores de heterocigosidad esperada según las proporciones de Hardy-Weinberg. Las diferencias pueden estar asociadas a eventos como la selección y la deriva génica, puesto que en la población de ganado Romosinuano existe un número reducido de reproductores, y que podrían estar aportando a la fijación de alelos específicos en las poblaciones evaluadas.

El valor PIC más alto lo presentó el alelo TGLA126 con 0.852,  mientras que el menor valor PIC se encontró en el marcador BM1824 con un valor de 0.629. El valor PIC para el conjunto de marcadores fue de 0.775.

Al igual que en la población de ganado BON, los marcadores seleccionados fueron altamente informativos y permitieron determinar la heterocigosidad presente en la población y constituyen un excelente indicador de la riqueza alélica de las poblaciones evaluadas. 

Cuando se determinó si los marcadores podían ser utilizados en pruebas de paternidad, se encontró que los marcadores empleados en esta raza permitieron obtener una probabilidad de exclusión del 99.5%. Los 91 alelos amplificados con el conjunto de marcadores nos garantizan una seguridad cercana al 100% en el análisis genético de la raza Romosinuano y de su utilización en pruebas de paternidad.

Consideraciones finales

Los resultados aquí presentados mostraron que los 10 marcadores utilizados y recomendados por la ISAG sirvieron para la caracterización de las razas BON y Romosinuano y podrían ser utilizados para pruebas de paternidad en estas razas.

Los resultados mostraron la existencia de alelos específicos para cada una de las razas incluidas, como se indica en la tabla 6. Estos alelos específicos, pueden ser evaluados en un individuo para determinar el más probable tipo racial de éste.

Los marcadores evaluados en las dos poblaciones de ganado criollo Colombiano BON y Romosinuano fueron polimórficos, y mostraron diferencias en cuanto a frecuencias alélicas y número de alelos para cada población. Este estudio contribuye al conocimiento de la estructura genética de las poblaciones de éstas razas de ganado y constituye una valiosa herramienta para el diseño de planes de conservación y repoblamiento de éstas.

La información encontrada en estas razas, puede ser incluida en futuros programas de selección y mejoramiento animal, ya que además de la evaluación genética, la información molecular permite establecer que tan diversos son los individuos que se emplearan como reproductores y de este modo se asegura que se transmita dicha variabilidad a la siguiente generación. Es importante que las poblaciones mantengan una variabilidad genética para que no se pierdan alelos que puedan contribuir al mejoramiento genético de las mismas a futuro.

De igual forma, la identificación de genética de los individuos, permitirá el fortalecimiento de los registros genealógicos y pruebas de paternidad, y se convierte  en una información base para la creación de bases de datos que sean la solución a problemas como el abigeato y la falta de trazabilidad en las cadenas de producción Bovina.

Agradecimientos 

Los autores agradecen a la Universidad de Antioquia, a las haciendas Vegas de la Clara (Gomez Plata Antioquia),  El Espejo (Uraba Antioqueño), Cardosa (Restrepo Valle), Manoa (Villavicencio Meta) y San Luís (Pachaquiaro Meta).

Referencias 

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Received 8 October 2008; Accepted 19 January 2009; Published 18 April 2009

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