Caracterización genética del búfalo Murrah en Colombia usando marcadores microsatélite

E Martínez*, J F Tirado*, M F Cerón-Muñoz*,**, M Moreno*,***, A Montoya*, J D Corrales* y S J Calvo*

* Grupo de Genética y Mejoramiento Animal, Instituto de Biología, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia

juanfernandotirado@hotmail.com

** Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Antioquia

***  Instituto de Biología, Universidad de Antioquia

Resumen

El objetivo de este estudio fue caracterizar genéticamente la raza Murrah mediante el análisis de marcadores moleculares del tipo microsatélites, utilizando la técnica de amplificación de PCR.

Los marcadores microsatélite BM1824, Inra37, SPS115 y BM2113 fueron polimórficos y los marcadores ETH10 y ETH225 fueron monomórficos. El mayor número de alelos fue 11 para el marcador Inra37 y el menor número de alelos fue 7 para el marcador BM2113. Los marcadores polimórficos no mostraron estar en equilibrio Hardy-Weinberg. La probabilidad de exclusión fue 96,6% para los seis marcadores y el más informativo fue el marcador Inra37 con un 84,3% de contenido de información polimórfica, por lo cual estos marcadores pueden ser utilizados en pruebas de paternidad en la población colombiana de la raza Murrah.

Palabras claves: Análisis de parentesco, Bubalus bubalis, genética animal, técnica de PCR

Genetic characterization of Murrah Buffalo breed in Colombia using microsatellite DNA markers

Abstract

The aim of this study was to characterize genetically the Murrah breed through analysis of microsatellite type of molecular markers, using the technique of amplification by PCR.

The BM1824, Inra37, SPS115, and BM2113 microsatellite markers were polymorphic and ETH10 and ETH225 were monomorphic. The largest number of alleles was 11 for the Inra37 marker and fewer alleles were 7 for the BM2113 marker. The polymorphic markers showed imbalance regarding the ideal balance Hardy-Weinberg. The probability of exclusion was 96.6% for all six markers and the most informative was the Inra37 marker whit a 84.3% of Polymorphic information content; therefore these markers can be used in paternity testing in the Colombian population of the Murrah breed.

Keywords: Bubalus bubalis, molecular genetics, parentage analysis, PCR technique

Introducción

En la especie bubalis se diferencian dos grupos denominados de río y de pantano, los cuales poseen 50 y 48 pares de cromosomas, respectivamente (Fischer y Ulbrich 1968). Dentro del búfalo de rio existen 18 razas utilizadas para la producción de leche y carne, entre ellas las principales son Murrah, Jafarabadi, Nili-Ravi, Nagpuri, Surti y la Mediterráneo (Sanint 2006). En Colombia se tienen búfalos puros de las razas Murrah y Mediterráneo y predomina el búfalo de origen trinitario denominado bufalypso (Sanint 2006). En la década de los 90’s y 2000 se dio una importación a Colombia de búfalos  Murrah de origen búlgaro y brasilero (Sanint 2006); de Brasil llegaron individuos de los principales linajes (Sanint 2006), los cuales se caracterizan por ser altamente endogámicos, dichos linajes se han distribuido en el territorio colombiano como animales puros de origen y cruzados con búfalo Murrah búlgaro y búfalo colombiano (Sanint 2006).

La caracterización genética de poblaciones, de razas y de especies permite comprobar el estado de la variabilidad genética, un elemento crucial en la determinación de estrategias de crianza y de programas genéticos de conservación (Pimentel et al 2003). Los marcadores moleculares se han utilizado en diferentes poblaciones y grupos raciales del género Bubalus en todo el mundo, tanto para caracterizaciones raciales como para la caracterización de grupos poblacionales con fines de conservación de especies o sub especies en peligro de extinción (Soysal et al 2005, Aranguren et al 2005).

El análisis de polimorfismos del ADN por medio de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) (Mullis y Faloona 1987) que consiste en la amplificación in vitro de un fragmento de DNA específico, es en la actualidad uno de los procedimientos más utilizados en las prácticas de genética molecular. La PCR es la técnica más aplicada para el estudio de loci altamente polimórficos como son los STRs (Short Tandem Repeats) o microsatélites, que constituyen regiones de ADN repetitivo de dos a siete pares de bases repetidas una a continuación de la otra, por lo que se les conoce como di, tri o tetranucleótidicas y suponen una fuente de marcadores de gran valor debido a su abundancia a lo largo de los genomas eucariotes, a su naturaleza altamente variable, es decir, polimórficas y su amplificación relativamente sencilla por medio de la PCR Estos generan un patrón de fragmentos de ADN, que son específicos para cada individuo, el cual está integrado por las combinaciones provenientes del linaje paterno y materno (Sun et al 1995, Sunden et al 1993).

El objetivo de este estudio fue caracterizar mediante  marcadores  microsatélites rebaños de búfalos Murrah puros de origen brasilero de los principales linajes que ingresaron a Colombia.

Materiales y métodos 

Fueron muestreados 100 animales de la raza Murrah, pertenecientes a las haciendas La Veranera y Media Luna, ubicadas en el municipio de Ayapel en el departamento de Córdoba, Colombia. Los animales fueron importados desde Brasil y poseen registro brasilero. Utilizando los registros de los animales se elaboró una matriz de parentesco de 278 individuos en ocho generaciones con un porcentaje de endogamia de 13.3% en 37 individuos endogámicos.

Se analizaron los marcadores microsatélite BM1824, Inra37, SPS115, BM2113, ETH225 y ETH10, incluidos en la lista de la ISAG (International Society of Animal Genetics) para estudios poblacionales en bovinos, ovinos y caprinos, utilizando la técnica de PCR (Mullis y Faloona 1987); la lista se puede obtener en  http://www.isag.org.uk/journal/comparisonguide.asp. La correspondiente ubicación cromosómica y la secuencia de los primers se muestran en la Tabla 1.

Se colectaron muestras de 4 ml de sangre de la vena coccigea en tubos con vacio y anticoagulante EDTA. El ADN se extrajo de las muestras por el método Salting Out descrito por Miller et al 1988.

Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 16μL, que contenían: ADN (30 µg); buffer de reacción 1X (10mM Tris-HCL pH 9.0; 50mM KCl; 0.1 % Triton® X-100); MgCl₂ (25mM); dNTPs (200 mM de desoxirribonucleótidos); Primer (0.2 mM de primer) y Taq-polimerasa (Promega, AmpliTaq gold, 5U/ml) y agua desionizada hasta completar el volumen. La amplificación se efectuó en un termociclador T-Personal 48 (Biometra® GMBH, D-37079 Goettingen, Germany).

Los seis marcadores se trabajaron en sistemas dúplex y se agruparon de acuerdo a la temperatura de apareamiento de los cebadores a la cual amplificaban bien. Los sistemas dúplex se denominaron: DBI para los marcadores BM1824 e Inra37; DBS para los marcadores SPS115 y BM2113 y DEE para los marcadores ETH10 y ETH225.

Las condiciones de la amplificación fueron un primer paso de 5 minutos a 95ºC seguido de 30 ciclos de amplificación (30 segundos a 94ºC, 45 segundos a 56ºC, 61ºC y 63ºC para los sistemas dúplex DBI, DBS y DEE respectivamente, y 45 segundos a 72ºC) seguido de un único ciclo de 15 minutos a 72ºC.

La visualización de los productos de  la PCR se realizó mediante electroforesis en geles desnaturalizantes de Poliacrilamida al 6%, con buffer TBE 0.5X y tinción con Nitrato de plata al 1%. La asignación  de genotipos se hizo teniendo como referencia una escalera alélica de fragmentos con tamaño conocido junto con los amplificados. La presencia de las repeticiones y los tamaños de los amplificados se corroboraron por medio de secuenciación.

Análisis estadístico

El análisis de los diferentes loci se realizo por medio del programa GDA, Genetic Data Analysis (Lewis y Zaykin 2001). Se evaluó si los datos genotípicos observados se ajustaban al modelo de equilibrio de Hardy-Weinberg, para lo cual se calculó la heterocigocidad observada y esperada (Nei 1972) para verificar el estado de la variabilidad genética de la población.

El contenido de información polimórfico (PIC) fue calculado para cada uno de los marcadores según lo descrito por Botstein y White 1980 y la probabilidad de exclusión (PE) fue calculada, tanto de forma individual, como para el conjunto de los marcadores según lo descrito por Jamieson 1994, con el fin de averiguar si estos marcadores microsatélite son útiles para estudios de caracterización de la raza y para pruebas de paternidad en individuos de la raza Murrah.

Resultados y discusión 

En el marcador BM1824 se encontraron nueve alelos, siendo los de mayor frecuencia 187 y 169 con 0.30 y 0.38, respectivamente (Tabla 2). Este rango es similar al encontrado por Navani et al 2001 en una muestra multirracial de Murrah, Nili-Ravi y Meshana, pero se encontraron tres alelos.

En el marcador Inra37 se encontraron once alelos, siendo los de mayor frecuencia 131, 129 y 125 con 0.26, 0.22 y 0.22, respectivamente (Tabla 2). Esto coincide con lo reportado por Ciampolini et al 2005 para vacunos Italianos de la raza Chianina, Limousin, Frisona y Charolais donde encontraron también once alelos para este marcador.

En el marcador SPS115 se encontraron nueve alelos, siendo los de mayor frecuencia el 252 y 248 con 0.41 y 0.22 (Tabla 2). El rango es similar a lo reportado para las razas vacunas Gir y Hosltein (Bicalho et al 2006), donde se encontraron ocho alelos.

En el marcador BM2113 se encontraron siete alelos, siendo los de mayor frecuencia el 129 y 127 con 0.45 y 0.18 (Tabla 2). Al contrario del estudio de Navani et al 2001, donde no amplificó en ninguna de las tres razas analizadas.

En el marcador ETH10 se encontró sólo el alelo 195. En la literatura se encuentra reportado el uso de este microsatélite en el búfalo de Anatolia (Soysal et al 2005), pero no se reporta como polimórfico, mientras que Navani et al 2001 en una muestra multirracial encontraron tres alelos.

En el marcador ETH225 se encontró sólo el alelo 129. En lo reportado por Navani et al 2001 también fue monomórfico en la muestra multirracial, pero el alelo encontrado era de 140 pares de bases.

Los marcadores microsatélite que resultaron monomórficos indican que se han fijado en la población posiblemente por selección indirecta, pues el análisis de pedigrí de la muestra poblacional indica que la mayoría de individuos proviene de unos pocos padres importados desde Brasil, esto quiere decir que posiblemente al utilizar los mejores reproductores para características de interés económico, indirectamente se fijaron los alelos 195 y 129 para los marcadores ETH10 y ETH225, respectivamente. Estos dos marcadores monomórficos podrían utilizarse como un patrón genético para identificar animales puros, pues si se prueba que estos alelos son privados para la raza Murrah se encontraran posiblemente polimorfismos en los locus de ETH10 y ETH225 en los animales cruzados, pero primero se tiene que realizar el estudio de estos dos marcadores en otras razas bufalinas en Colombia para comprobar la hipótesis.

El marcador Inra37 tuvo un exceso de heterocigóticos, también en éste se encontró el mayor número de alelos como se muestra en la Tabla 3. Esto da cuenta de su variabilidad, pues siendo la muestra de animales endogámicos, los alelos no se pierden en la población, pero sí cambian sus frecuencias, esto se comprueba con su Contenido de información polimórfica pues fue la más alta de todos los marcadores, como se muestra en la Tabla 3.

Los otros tres marcadores polimórficos tuvieron un déficit de heterocigóticos; en conjunto la heterocigocidad de los marcadores indica que la población no se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg, por lo tanto la población esta variando genéticamente en el tiempo y posee variabilidad genética respecto a los loci analizados. Estos marcadores polimórficos dan cuenta que otras regiones del genoma de la raza están variando también, por lo tanto se espera que dentro de la población hayan diferencias genéticas para poder realizar selección y mejoramiento genético

La población analizada es relativamente pequeña y además ha sufrido procesos de selección, pues por análisis de pedigrí se encontró que algunos individuos son endogámicos. También, esta población ha sufrido procesos de migración por la importación de animales de Brasil y material genético como pajillas de Bulgaria. Por todo lo anterior es de esperarse que la población de búfalos Murrah en Colombia no se encuentre en equilibrio de Hardy-Weinberg.

El contenido de información polimórfica (PCI) superior al 70% en cuatro de los seis marcadores analizados, sugiere que son informativos y utilizados en grupo aportan un 76,2% de poder de discriminación de un individuo con respecto a la población y una probabilidad de exclusión de 96,6%. Lo anterior junto con un panel de 35 alelos posibles de los encontrados en los productos de amplificación para los marcadores polimórficos, convierte a esta selección de microsatélites en una pieza importante para conformar una batería de marcadores microsatélites para realizar pruebas de paternidad, lo que significa que los ganaderos podrán tener certeza del pedigrí de sus animales y del material genético que en un momento determinado sea necesario verificar para poder así programar apareamientos de animales superiores en pro del mejoramiento genético de sus hatos. Los valores del PCI y Probabilidad de exclusión (PE) se encuentran en la Tabla 3.

Conclusiones

• Los marcadores microsatélite BM1824, Inra37, SPS115 y BM2113 fueron polimórficos y los marcadores microsatélite ETH10 y ETH225 fueron monomórficos en  la raza Murrah en Colombia.

  
  

• Además, que la población no se encuentra en equilibrio de Hardy-Weinberg para los marcadores BM1824, Inra37, SPS115 y BM2113, resultado de la migración y selección de la población en estudio.

  
  

• Este estudio es una contribución a futuras investigaciones acerca del género Bubalus, principalmente por la hipótesis de alelos privados de los marcadores ETH10 y ETH225 para la raza Murrah y también para determinar una batería de marcadores microsatélite para pruebas de paternidad en individuos de la raza, todo con el fin de ayudar a enriquecer la explotación del búfalo en Colombia mediante programas de registro genealógico, de control productivo de carne y leche, de mejoramiento genético y selección de individuos superiores para la reproducción.
   

Agradecimientos 

Los autores agradecen al Zootecnista Mariano Gutiérrez, Director del programa de registro genealógico de la Asociación de Criadores de Búfalos, a las Haciendas “Media Luna” y “La Veranera”, a la Asociación de Criadores de Búfalos y al Laboratorio de Genética Animal del Instituto de Biología de la Universidad de Antioquia.

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Received 10 June 2008; Accepted 6 October 2008; Published 1 January 2009

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