| Livestock Research for Rural Development 17 (6) 2005 | Guidelines to authors | LRRD News | Citation of this paper |
La proteína microbiana constituye una proporción considerable del flujo duodenal de nitrógeno aminoacídico en los rumiantes y la maximización en su producción es la forma más económica de suplementar proteína al ganado; además, la composición de aminoácidos de la proteína verdadera es similar a la de la proteína de los principales productos animales, destacándose por su alta calidad nutricional. La síntesis de proteína microbiana varía debido a la influencia de varios factores relativos a la dieta o al ambiente ruminal, por lo que su cuantificación es un punto crítico en los sistemas de valoración nutritiva, en especial en los animales que presentan altos niveles de producción. El procedimiento basado en la determinación de marcadores para la medición de la producción de proteína microbiana ha sido el más utilizado, pero presenta varios puntos conflictivos, entre ellos la necesidad de emplear animales canulados.
Los derivados purínicos son constituyentes de las células microbianas, se encuentran principalmente en forma de nucleótidos y los más representativos son los de la adenina y de la guanina. Los ácidos nucleicos microbianos que abandonan el rumen sufren una digestión extensiva en el intestino delgado, con lo que los nucleótidos de purina son hidrolizados en nucleósidos y bases libres, las cuales después de ser absorbidas se metabolizan de forma diferente dependiendo de la especie animal, en razón a la diferencia en la distribución tisular de la xantina oxidasa. La excreción urinaria es la primera ruta para la disposición de los derivados púricos, siendo la saliva y la leche otras vías de excreción que cuantitativamente representan una pequeña proporción. Debido a que las purinas que llegan al duodeno pueden ser posteriormente metabolizadas por el animal y excretadas en la orina en forma de alantoína y otros metabolitos, se ha propuesto a la excreción urinaria de derivados púricos como un parámetro válido para estimar, a través de ecuaciones, el flujo duodenal de proteína microbiana. La magnitud de esta fracción no es constante entre especies y al parecer, los animales del trópico excretan una menor proporción de los derivados púricos plasmáticos que aquellos de áreas templadas.
Palabras clave: ácido úrico, alantoína , flujo duodenal de nitrógeno aminoacídico, proteína microbiana, purinas
Microbial protein constitutes a considerable proportion of the duodenal amino-acid nitrogen flow in ruminants and its maximization is the more economic form to supply protein to the cattle. In addition, the amino acid composition in true protein is similar to the one in protein from main animal products, characterized by its high nutritional quality. The microbial protein synthesis varies due to the influence of several factors related to diet or ruminal environment, reason why its quantification is a tactically important point in the of nutritional valuation systems, especially for animals with high production levels. The procedure based on the determination of markers for the measurement of microbial protein production has been the most used, but it displays several conflicting points, among them the necessity to use fistulated animals.
Purine derivatives are constituents of microbial cells, they are mainly in the form of nucleotides and the most representative are those from adenine and guanine. Microbial nucleic acids that leave the rumen undergo an extensive digestion in the small intestine, this way the purine nucleotides are hydrolyzed into nucleosides and free bases, which after being absorbed are degraded in different forms depending on the animal species, because of the difference in the tissue distribution of xanthine oxidase. Urinary excretion is the first route for purine derivatives, saliva and milk being other routes of excretion that quantitatively represent a small proportion. Because the purines that arrive at the duodenum can later be degraded by the animal and excreted in the urine in form of allantoin and other metabolic end products, urinary excretion has been proposed as a valid parameter to estimate, through equations, the duodenal microbial protein flow. The magnitude of this fraction is not constant between species and it seems that animals from the tropics excrete a smaller proportion of the plasma purine derivatives than those from temperate latitudes.
Key words: Allantoin, duodenal amino-acid nitrogen flow, microbial protein, purines, uric acid
En la alimentación de bovinos, dietas deficientes en cualquier nutriente reducirán la producción de leche y de sus componentes; sin embargo, el suministro de cantidades excesivas puede disminuir la eficiencia de su utilización, incrementar los costos de producción y generar la excreción de los remanentes no utilizados al ambiente con eventuales efectos nocivos en el entorno. Uno de los principales objetivos de la nutrición proteica de los rumiantes es el de proporcionar cantidades adecuadas de proteína degradable en el rumen para aumentar la eficiencia ruminal y para obtener el máximo rendimiento animal con una cantidad mínima de proteína de origen dietético (NRC 2001). Al respecto, un aspecto de interés mundial es el entendimiento de los procesos involucrados en el ciclo del nitrógeno (N) a través de los sistemas de producción, dada la conocida ineficiencia en la utilización de dicho componente, ya que se reporta que sólo el 30% de la proteína total consumida por los rumiantes es convertida en carne y leche (Anon 1995; Bahadur 1997).
Para poder inferir sobre las necesidades proteicas del ganado y maximizar su eficiencia es necesario cuantificar la síntesis de este nutriente por parte de los microorganismos ruminales. Uno de los mayores impedimentos para obtener información fiable sobre este aspecto es la falta de un método simple y preciso (Chen y Gomes 1995; Carro 2001). La cuantificación a través de la determinación de marcadores presenta desventajas tales como: el empleo de animales canulados (Vagnoni et al 1997; Tebot et al 2002), la dificultad en la obtención de una muestra representativa de la población microbiana y las limitaciones inherentes a cada marcador (Obispo y Dehority 1999). Una vez que los ácidos nucleicos microbianos abandonan el rumen, sufren una digestión extensiva en el intestino delgado, los nucleótidos de purina son hidrolizados en nucleósidos y bases libres, las cuales después de ser absorbidas, son metabolizadas por el animal y excretadas en la orina en forma de alantoína y otros metabolitos. Por tanto, se ha propuesto que la excreción urinaria de derivados púricos es un parámetro válido para estimar, a través de ecuaciones, la síntesis de proteína microbiana (Chen y Gomes 1995; Funaba et al 1997).
La estimación del aporte de proteína de origen microbiano en los rumiantes se ha convertido en una importante área de estudio en la nutrición proteica de estos animales y está siendo incorporada en los sistemas de evaluación nutricional utilizados en muchos países (Chen y Gomes 1995). No existen en nuestro medio estimados del aporte de proteína microbiana en los rumiantes que den cuenta del papel que cumplen los recursos forrajeros como alimentos básicos. El conocimiento de dicho proceso permitirá generar alternativas de alimentación más eficientes y ambientalmente sostenibles. Con esta revisión se pretende describir los conocimientos relacionados con la excreción urinaria de derivados púricos como técnica para estimar la síntesis de proteína microbiana, incluyendo las diferencias en el metabolismo entre especies animales.
En los rumiantes la presencia de microorganismos en el retículo-rumen permite a estos animales transformar las complejas estructuras de la pared celular de los forrajes en elementos nutritivos que pueden ser utilizados para su mantenimiento y funciones productivas (Carro 2001).
Los aminoácidos que llegan al duodeno pueden tener tres orígenes diferentes, la proteína microbiana sintetizada en el rumen, la sobrepasante y la de origen endógeno (Calsamiglia et al 1996). Los microorganismos utilizan el amonio, los aminoácidos y pequeños péptidos para producir proteína, la cual se compone de 75% de proteína verdadera y 25% de ácidos nucleicos (AFRC 1993). Ella representa entre el 40 y el 90% de los aminoácidos que llegan al intestino delgado, aunque en ocasiones puede alcanzar el 100% (Samaniego 1996) y tiene un importante papel en la nutrición de los animales rumiantes porque su composición aminoacídica es similar a la de la proteína de los principales productos animales (Verbic 2002). El aporte de nitrógeno microbiano al animal varía entre 14 y 60 g (NM)/kg de materia orgánica digestible fermentable en el rumen(MODR)(ARC 1984), variación debida a la influencia de varios factores relativos a la dieta o al ambiente ruminal (Bahadur 1997).
Debido al papel que juegan los microorganismos
ruminales en la digestión de las estructuras de la pared
celular y a que la proteína microbiana tiene una gran calidad,
las raciones de los rumiantes deben ser formuladas para permitir el
máximo crecimiento microbiano (Carro 2001).
Los marcadores microbianos se clasifican en internos (purinas, ácidos nucleicos) y externos (15N, 35S), según sean o no constituyentes de los microorganismos (Santos et al 2001). Las purinas se encuentran en la célula principalmente en forma de nucleótidos, los cuales participan como precursores de los ácidos nucleicos y almacenes de energía. En términos cuantitativos, los principales derivados purínicos en la célula son los de la adenina y de la guanina, aunque otras bases como la hipoxantina y la xantina también están presentes (Devlin1993). La utilización de los ácidos nucleicos y las purinas se basa en las altas concentraciones de ADN y, especialmente de ARN, presentes en los organismos unicelulares (Carro 2001). Su empleo se remonta a la década de los sesenta, en la que diversos autores observaron que la síntesis de proteína microbiana en el rumen estaba relacionada con el flujo total de polinucleótidos al duodeno (Ellis y Pfander 1965) y con la excreción urinaria de derivados púricos (Topps y Elliot 1965).
Una vez que los ácidos nucleicos microbianos abandonan el rumen, sufren una digestión extensiva en el intestino delgado, los nucleótidos de purina son hidrolizados en nucleósidos y bases libres, las cuales son absorbidas. En los bovinos la gran mayoría de las bases libres son degradadas hasta ácido úrico en su paso por la mucosa, debido a la alta actividad de la xantina oxidasa, trayendo como consecuencia una limitada disponibilidad de ellas para su incorporación en los ácidos nucleicos tisulares, proceso denominado reciclaje. En las ovejas, la actividad de la xantina oxidasa es insignificante y por lo tanto, las purinas absorbidas pueden ingresar al hígado inmodificadas, estando disponibles para la incorporación en los ácidos nucleicos tisulares. Sin embargo, en el hígado la actividad de las enzimas para el reciclaje y la degradación es muy activa y habrá competencia por los substratos, por lo que las purinas absorbidas que no sean incorporadas en los ácidos nucleicos tisulares son completamente convertidos en sus productos metabólicos finales, alantoína, ácido úrico, xantina e hipoxantina (Chen y Gomes 1995; Sandoval y Herrera 1999).
Los derivados púricos que ingresan en la circulación provenientes de la degradación de los ácidos nucleicos tisulares son conocidos como derivados púricos endógenos (Orellana et al 2001). La magnitud de esta fracción no es constante entre especies (Gonzáles et al2003). La excreción endógena de derivados púricos es más alta en los bovinos (entre 0.450-0.560) que en los ovinos y caprinos (entre 0.150-0.200 mmol//kg PV0.75/día) (Sandoval y Herrera 1999), lo cual se explica por la diferencia en la distribución tisular de la xantina oxidasa. Los bovinos tienen una alta actividad de la enzima en muchos tejidos incluyendo la sangre, mientras que las ovejas y las cabras tienen una baja actividad en muchos tejidos y ninguna en la sangre. En bovinos, la alta actividad de la xantina oxidasa desviará una mayor cantidad de purinas, liberadas por la degradación de los ácidos nucleicos tisulares, desde el reciclaje hacia la degradación, por lo que la síntesis de purinas de novo desde aminoácidos es necesaria, resultando en una contribución neta endógena (las pérdidas endógenas menos las purinas exógenas utilizadas) inevitable y en una curva de excreción de derivados púricos vs. purinas absorbidas lineal. En ovinos y caprinos, cuando se tiene en cuenta la cantidad de purinas exógenas utilizadas por el animal para el reciclaje, la contribución neta endógena es reducida, por lo que en la medida en que la cantidad de purinas microbianas absorbidas aumenta, la contribución neta endógena decrece prácticamente a cero, trayendo como consecuencia una curva de respuesta de excreción de derivados púricos vs. purinas absorbidas no lineal (Chen y Gomes 1995; Sandoval y Herrera 1999).
Belenguer et al (2002) indican que la excreción de derivados púricos durante el ayuno puede ser considerada como una estimación próxima a las pérdidas endógenas cuando no existe otro método disponible para su determinación.
La excreción urinaria es la primera ruta para la eliminación de los derivados púricos (Chen y Gomes 1995). El tiempo transcurrido entre la absorción duodenal de bases púricas y la excreción urinaria de sus derivados es de 24 horas (Orellana et al 2001). La alantoína, el ácido úrico, la xantina y la hipoxantina están presentes en la orina de la cabra y la oveja, pero solamente la alantoína y el ácido úrico están presentes en el vacuno por la alta actividad de la xantina oxidasa en la sangre y en los tejidos (incluyendo el riñón), convirtiendo la xantina y la hipoxantina en ácido úrico previamente a la excreción en la orina (Valadares et al 1999).
La excreción urinaria de derivados púricosestá directamente relacionada con la absorción de purinas, de tal forma que si se conoce la relación N-púrico: N total en la biomasa microbiana y la digestibilidad de las purinas, el nitrógeno microbiano absorbido en el intestino delgado puede ser calculado desde la cantidad de purinas absorbidas, estimadas a su vez desde los derivados púricos excretados en la orina (Chen et al 1992; Valadares et al 1999). El método requiere por lo tanto la colección total de la orina (Santos et al 2001) y se ha señalado que para reducir los errores debidos a la variación en la producción de orina, la colección debe realizarse por lo menos durante cinco días (Valadares et al 1999).
Otras vías de excreción de derivados púricos son la saliva y la leche, pero representan una pequeña proporción (Carro 2001). Una vez que la alantoína y el ácido úrico son secretados en la saliva, ellos no pueden reingresar en la sangre para su excreción en la orina, debido a la degradación efectuada por los microorganismos ruminales y/o por aquellos residentes en el intestino (Chen y Gomes 1995).
Giesecke et al (1994) consideran la excreción de alantoína en leche como un método útil y no invasivo para monitorear la síntesis de proteína microbiana en el rumen, dada la alta correlación encontrada entre la cantidad excretada y su concentración en el plasma (r=0.84), sin embargo, ellos también plantean la posible actividad de la uricasa en la leche, lo que contribuiría a la presencia de alantoína de origen mamario. De igual forma, otros autores argumentan que el potencial puede ser limitado en vista de que la cantidad de alantoína en la leche, como proporción de la excreción total, varía en función de la producción diaria, de tal forma que cuando la respectiva producción se aumente por medio de proteína sobrepasante, habrá un incremento concomitante en la excreción de alantoína, lo cual no necesariamente será el resultado del aumento en el flujo de bases púricas hacia el intestino delgado (Santos et al 2001; Tamminga et al2000). La alantoína excretada en la leche representa un porcentaje mínimo del total excretado diariamente, entre el 1 y el 4% dependiendo del nivel productivo (Giesecke et al 1994).
Con el fin de calcular la absorción de purinas desde la excreción diaria de derivados púricos se utilizan diferentes ecuaciones para ovinos, caprinos y bovinos (Samaniego 1996). Para las dos primeras especies animales, Chen et al (1990) obtuvieron una relación entre la excreción urinaria total (de origen endógeno y exógeno) de derivados púricos (Y) (mmol/d) y la absorción de purinas exógenas (X) (mmol/d) con la siguiente ecuación: Y = 0.84X+0.150PV0.75e-0.25x, donde 0.84 representó la proporción de los derivados púricos absorbidos excretados en la orina (tasa de recuperación de las purinas absorbidas), 0.150 la excreción de derivados endógenos (mmol/kg PV0.75/d), medida cuando el animal no tuvo aporte de purinas exógenas, y 0.25 la constante definiendo la tasa de reemplazo de la síntesis de novo de purinas por purinas exógenas. Para los bovinos, Verbic et al (1990) plantearon la ecuación Y=(0.385 PV0.75) + 0.85X., donde Y es la excreción urinaria total de derivados púricos (mmol/d); X son las purinas exógenas absorbidas (mmol/d), 0.385 la excreción endógena y 0.85, la recuperación de purinas absorbidas. Sandoval y Herrera (1999) plantean que esta última ecuación sólo puede aplicarse bajo condiciones de alimentación, donde se presente una excreción de derivados púricos mayor a 35 mmol/d. En los trópicos bajo condiciones de subalimentación, el flujo de bases purínicas al intestino delgado pudiera ser menor que el necesario para reemplazar la síntesis de novo (35 mmol/d), por lo que bajo estas circunstancias la excreción endógena de derivados púricos no es constante, debiendo considerar la fracción de reemplazo de la síntesis de novo, resultando la ecuación: Y=0.85X+(0.385+0.108 exp-0.16)PV0.75 (Sandoval y Herrera 1999)
Cuando se usan los modelos cuantitativos para la estimación de la cantidad de purinas absorbidas a nivel del intestino delgado, la cantidad de nitrógeno microbiano (síntesis ruminal de N microbiano (g/d)) en bovinos y ovinos puede ser estimada a partir de la siguiente fórmula: NM=70X/(0.83*0.116*1000)=0.727X, donde 70 es el contenido de nitrógeno de las purinas (mg/mmol); X, son las purinas absorbidas (mmol por día); 0.83, la digestibilidad de las purinas microbianas y 0.116, la relación entre el nitrógeno purínico y el nitrógeno total en la biomasa bacteriana mixta (Krause et al2003). Valadares et al (1999), introducen una modificación en la ecuación, sustituyendo una relación N púrico/N total en las bacterias de 0.116 (11.6/100) por una de 0.134.
La utilización de la excreción urinaria de derivados púricos para estimar la síntesis microbiana de proteína presenta varias ventajas, entre ellas su rapidez, facilidad y el hecho de reflejar cambios en la eficiencia de digestión y absorción de los microorganismos (Carro 2001), pero la ventaja principal es que se trata de una técnica no invasiva, con lo que posibles trastornos en el comportamiento alimentario de los animales o en su motilidad digestiva, producidos por la implantación de cánulas, quedan descartados (Calsamiglia et al 1996).
Pese a ello, el método también presenta algunos inconvenientes. En primer lugar, considera que los ácidos nucleicos que abandonan el rumen son esencialmente de origen microbiano (Santos et al 2001; Tebot et al 2002), lo cual se basa en que los alimentos empleados en rumiantes tienen un bajo contenido de purinas (ácidos nucleicos), muchas de las cuales sufren degradación extensiva en el rumen como resultado de la fermentación microbiana (Giesecke et al 1994; Samaniego 1996). Sin embargo, los ingredientes que forman parte de las raciones de los animales contienen, en mayor o menor cantidad, purinas. Funaba et al (1997) indican que cuando las fuentes de proteína son ricas en la fracción pobremente degradable en el rumen, pero eficientemente digerida en el intestino delgado (e.g. harina de pescado), la presunción de una completa degradación de las purinas alimenticias en el rumen no es cierta. De otra parte, en animales en pastoreo y/o con bajo nivel de suplementación, la contribución de purinas dietéticas será nula o mínima (Sandoval y Herrera 1999), aunque de todas formas los ácidos nucleicos de los alimentos de origen vegetal se encuentran protegidos por la pared celular (Carro 2001). En la medida en que el flujo duodenal de purinas de origen alimenticio sea mayor, se provocará una sobreestimación de la síntesis de proteína microbiana (Carro 2001).
Un segundo inconveniente de las purinas como marcador microbiano es que la relación purinas/N no es la misma en las bacterias y protozoos, e inclusive varía entre las diferentes especies bacterianas. El método asume que la relación de purinas/N total es constante en la mezcla de la población microbiana. Se ha observado que las bacterias asociadas a la fase sólida (BAS) presentan un menor contenido en purinas (o en ARN y ADN) y una menor relación purinas/N que las bacterias asociadas a la fase líquida (BAL). Estas diferencias parecen deberse a las características intrínsecas de las diferentes especies que integran cada fracción bacteriana y al menor ritmo de crecimiento de las BAS en comparación con las BAL. La relación entre bacterias asociadas con el fluido y aquellas asociadas con partículas alimenticias está sujeta a considerable variación dependiendo del tipo de ración que reciben los animales, por lo que la proporción de estas últimas puede variar entre 50 y 80%, aunque en raciones constituidas exclusivamente por forrajes puede llegar a ser del 90%. Adicionalmente, existen diferencias en la tasa de flujo de salida entre la fase líquida y las partículas alimenticias, lo que determina también el flujo de las BAL y las BAS. En consecuencia, casi la totalidad de los estudios en los que se han utilizado las BAL como muestra de referencia, se provoca una subestimación de la síntesis de proteína microbiana, por lo que una solución válida para aminorar este inconveniente consiste en obtener muestras bacterianas representativas de todas las población ruminal (Tamminga et al 2000; Carro 2001).
Los protozoos que pasan al abomaso y al duodeno contribuyen también al flujo duodenal de purinas, sin embargo, la cuantificación de proteína procedente desde estos microorganismos presenta una gran dificultad debido a que a sufren una retención selectiva en el rumen por su adhesión a las partículas de alimento (Carro 2001). Samaniego (1996) afirma que el limitado pasaje podría subestimar la síntesis microbiana. En los protozoos la relación purinas/N suele ubicarse en torno al 50% de la que presentan las bacterias, por lo que la síntesis de proteína microbiana se subestima cuando se utilizan bacterias como muestra de referencia (Carro 2001).
Un tercer inconveniente del método es que la relación purinas/N en las bacterias cambia tras la administración de alimento a los animales (Calsamiglia et al1996). Craig et al (1987) observaron que los valores de la relación purinas/N en las bacterias ruminales (BAS y BAL) fueron mínimos inmediatamente antes de la administración de alimento y aumentaron hasta presentar valores máximos, entre 33 y 44% superiores a los registrados anteriormente, entre las 7 y 9 horas luego del suministro del mismo. Este problema, sin embargo, puede disminuirse realizando muestreos seriados del contenido ruminal, de tal forma que se abarquen todas las fases del ciclo alimenticio (Cecava et al 1990).
La relación purinas/N se ve afectada por las características de la ración, como son la cantidad de proteína de la misma y su relación forraje:concentrado, por lo que el análisis de esta relación en animales que reciben raciones de diferente calidad y administradas a diferentes niveles resulta apropiado (Carro 2001).
Debido a que la colecta total de orina no es práctica en circunstancias no experimentales, el uso de la proporción derivados púricos totales:creatinina, relacionada con la salida diaria de derivados púricos, se convierte en una alternativa para obviar este procedimiento (Chen et al 1995; Shingfield y Offer 1999). Esta metodología sin embargo presenta una sensibilidad más baja, no siendo apropiada para comparar tratamientos dietarios donde hay sólo una pequeña diferencia en el aporte de nitrógeno microbiano (Tamminga et al 2000).
Chen et al (1992) después de garantizar alimento a bueyes en una o dos tomas diarias, encontraron que la magnitud de la fluctuación en la relación urinaria de alantoína (o derivados púricos totales) a creatinina fue relativamente pequeña, concluyendo que dichos parámetros en muestras aleatorizadas de orina pueden ser válidos estimar el aporte de proteína microbiana, máxime en animales alimentados ad libitum o que están pastoreando, donde la variación diurna podría ser menor. Chen et al (1995) garantizando alimentación ad libitum en ovejas reportaron que la relación en la concentración derivados púricos:creatinina fue linealmente correlacionada con la excreción de derivados púricos (r=0.92).
La creatinina es producida irreversiblemente en el tejido muscular desde la fosfocreatina, el cual es un compuesto que posee energía libre de hidrólisis similar a la del ATP. Dado que la cantidad de creatina fosfato es proporcional a la masa muscular corporal, la formación espontánea de creatinina es característica de cada individuo (Devlin 1993).
Los análisis químicos de derivados púricos pueden ser realizados a través de cromatografía líquida de alto desempeño (HPLC), autoanálisis y espectofotometría (Tamminga et al 2000).
La HPLC ha posibilitado una alta aproximación analítica al permitir una recuperación de las purinas cercana al 100% (Czauderna y Kowalczyk 2000, Giesecke et al 1994). Otras ventajas del método son los bajos coeficientes de variación y los bajos límites de detección y cuantificación, indicando una satisfactoria precisión, reproducibilidad y sensibilidad (Balcells et al 1992; Chen et al 1993, Czauderna y Kowalczyk 2000).
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Received 5 February 2005; Accepted 24 April 2005; Published 1 June 2005