| Livestock Research for Rural Development 17 (4) 2005 | Guidelines to authors | LRRD News | Citation of this paper |
El desempeño productivo de los rumiantes está en función del valor nutricional de la dieta que consumen. La evaluación del valor nutricional puede realizarse por métodos in vivo, in situ e in vitro; dentro de estos últimos se encuentra la técnica de producción de gases, la cual a diferencia de otras técnicas in vitro e in situ, no sólo determina la extensión, sino también la cinética de degradación del alimento a través del volumen de gas liberado, directamente como un producto de la fermentación, principalmente cuando se produce mayor proporción molar de acetato y butirato, e indirectamente desde la neutralización del fluido ruminal.
Al igual que otras técnicas de bioensayo, la técnica de producción de gases emplea sustratos molidos, medio anaeróbico, temperatura de 39ºC e inóculo ruminal. La técnica puede medir el volumen de gas a presión atmosférica constante, la presión de gas a un volumen fijo, o hace una combinación de ambos procedimientos; disponiendo para tal efecto de metodologías manuales, semiautomáticas y automáticas. Los perfiles de producción de gas obtenidos pueden ajustarse a diferentes ecuaciones para resumir la información cinética, permitiendo la comparación de los sustratos, la evaluación de diferentes ambientes de fermentación y la obtención de las tasas de fermentación de los constituyentes solubles y estructurales. Si determinaciones gravimétricas son realizadas a determinados intervalos de tiempo, la producción de gas por unidad de materia seca o de materia orgánica puede ser cuantificada.
Algunos de los factores que afectan la producción de gas se encuentra el tipo de sustrato y de inóculo, la especie animal donadora del inóculo, su alimentación, el pH del medio y el tampón empleado.
Palabras clave: Degradabilidad, fermentación, in vitro, producción de gas, rumiantes
The productive performance of ruminants is based on the nutritional value of the diet. The evaluation of feed can be made by methods in vivo, in situ and in vitro. The in vitro gas production technique determines the extension and the kinetics of feed degradation through the volume of released gas, directly as a product of the fermentation and indirectly from the neutralization of the ruminal fluid. As with other techniques, the in vitro gas production technique uses milled substrates, buffer medium, temperature of 39ºC and ruminal inoculum. This technique can measure the volume of gas to constant atmospheric pressure, the pressure of gas to a fixed volume, or a combination of both procedures, employing manual, semiautomatic and automatic methodologies. The profiles of gas production obtained can be adjusted to different models to study the kinetics of degradation, allowing the comparison of substrates, different fermentation environments and the estimation of the rates of fermentation of the soluble and structural components. If gravimetric determinations are made at certain time intervals, the gas production by unit of dry matter or organic matter can be quantified. Some of the factors that affect the gas production are type of substrate and the source inoculum, the diet of the donor animal and the pH of the buffer medium.
Key words: Degradation, fermentation, gas production, in vitro, ruminants
La producción de leche y el crecimiento de los rumiantes son limitados por la calidad del forraje, lo cual se refleja principalmente en bajo consumo voluntario y baja digestibilidad. Por lo tanto, métodos precisos y prácticos para la evaluación del valor nutricional de los forrajes son de reconocida importancia. Los nuevos programas de evaluación de raciones (NRC 2001; Fox et al 1992; Sniffen et al 1992; Russel et al 1992)) requieren información detallada de la cinética de digestión de las diferentes fracciones del alimento, lo que hace necesario refinar los métodos para obtener la información solicitada. Expresiones cuantitativas de la cinética de digestión son necesarias para estimar de una forma más precisa la cantidad de nutrientes digeridos desde los alimentos y las propiedades intrínsecas de éstos que limitan su disponibilidad para los rumiantes (López et al 1998).
Las características de fermentación de los alimentos en el rumen pueden ser estudiadas por métodos in vivo, in situ e in vitro. Debido a que en los estudios in vivo los alimentos sólo pueden ser evaluados en raciones totales y al hecho de que tales estudios requieren considerables recursos y son difíciles de estandarizar, en los últimos años varias técnicas in situ e in vitro han sido desarrolladas. Dentro de las técnicas in vitro, la de uso más frecuente es la descrita por Tilley y Terry (1963), la cual fue modificada por Goering y Van Soest (1970) para estimar la digestibilidad verdadera de la materia seca (MS). Otra técnica in vitro consiste en la utilización de enzimas en lugar de microorganismos, cuya principal ventaja es que no requiere animales como donadores de inóculo. Las dos anteriores técnicas son usadas como procedimientos para estimar la digestibilidad final del sustrato y no proveen información sobre la cinética de digestión. La técnica de la bolsa de nylon supera esta limitante al proporcionar estimativas de la tasa y la dinámica de la degradación de los constituyentes del alimento; sin embargo, es una aproximación laboriosa, costosa e invasiva, en la que solamente un pequeño número de muestras pueden ser evaluadas al tiempo.
La técnica de producción de gases es otro método in vitro que permite determinar la extensión y la cinética de degradación del alimento a través del volumen de gas producido durante el proceso fermentativo (Theodorou et al 1994). Una de las ventajas de este procedimiento es que el curso de la fermentación y el papel de los componentes solubles del sustrato puede ser cuantificado (Pell et al 1997). Otro problema inherente a los métodos in situ e in vitro que se han tratado de solucionar a través de la técnica de producción de gas es el estudio de las fases tempranas de la fermentación, ya que los procedimientos gravimétricos no son lo suficientemente sensibles para medir los pequeños cambios que ocurren en el peso del sustrato durante las primeras horas de fermentación (Rosero 2002).
La energía para el crecimiento microbiano es derivada de la fermentación de los carbohidratos, principalmente almidón y celulosa, cuya digestión anaerobia produce ácidos grasos volátiles (AGV), succinato, formato, lactato, etanol, dióxido de carbono (CO2), metano (CH4), y trazas de hidrógeno (H2); sin embargo, ellos también aportan esqueletos de carbono esenciales para la síntesis de biomasa microbiana (Opatpatanakit et al 1994; Schofield et al 1994). La producción de gas desde la fermentación de la proteína es relativamente pequeña y la derivada desde la grasa es insignificante (Makkar 2001).
En la prueba de producción de gas in vitro usando tampón de bicarbonato, el CO2 es también producido en la neutralización de los AGV generados (Pell y Schofield 1993). Para los forrajes, cuando el tampón de bicarbonato es usado, alrededor del 50% del volumen total de gas producido tiene este origen, y puede aproximarse al 60% en dietas con alta proporción molar de propionato (Getachew et al 1998). El CO2 producido desde el tampón puede encontrarse asumiendo que por cada mmol de AGV producido se libera 0.8-1.0 mmol de CO2, dependiendo de la cantidad de tampón de fosfato presente (Opatpatanakit et al 1994; Makkar 2001).
En conclusión, la técnica de producción de gas mide la cantidad de gas liberado directamente como un producto de la fermentación e indirectamente desde el fluido ruminal neutralizado (Schofield et al 1994).
El gas es producido principalmente cuando el sustrato es fermentado hasta acetato y butirato. La fermentación del sustrato hasta propionato produce gas solamente desde la neutralización del ácido; por consiguiente, una menor producción de gas es asociada con la fermentación propiónica (Getachew et al 1998).
La técnica de gas registra la acumulación del volumen de gas estableciendo relaciones estequiométricas entre la producción de AGV y el volumen de gas (Blümmel et al 1999). Las reacciones estequiométricas de la fermentación de las hexosas descritas por Hungate (1966) fueron:
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1 hexosa + 2H2O → → |
2 acetato + 2CO2 + 4H2 |
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1 hexosa + 2H2 → → |
2 propionato + 2H2O |
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1 hexosa → → |
1 butirato + 2CO2 + 2H2 |
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CO2 + 4H2 → → |
CH4 + 2H2O |
La formación de ácido propionico es la única reacción que requiere de H2; por lo que cualquier remanente de H2 es usualmente convertido a CH4. Igualmente, la producción de propionato no involucra la generación de CO2 (Williams 2000).
La vía completa de producción de AGV desde dietas altas en forraje fue resumida por Beever (1993) como:
1 mol de hexosa → 1.34 mol acetato+0.45 mol propionato+0.11 mol butirato+0.61 mol metano+4.62 mol ATP.
La cantidad y la proporción molar de acetato (a), propionato (p) y butirato (b) determina las moles de CO2 y CH4 producidas. La estequiometría de Wolin (1960) asume que el balance de oxidación neta de todos los productos es igual a cero (a+p+b+CO2+CH4=0), que el CO2 y el CH4 son producidos únicamente desde el acetato y el butirato y que relativamente al acetato, el doble de la cantidad de CO2 y CH4 es generada desde la formación de butirato (CO2+CH4=a+2b). Después de algunas sustituciones, la ecuación resultante es: CO2=a/2+p/4+1.5*b. Así, las moles de CO2 producidas pueden ser calculadas desde la cantidad y proporción molar de acetato, propionato y butirato, y una vez las moles de CO2 son conocidas, las moles de CH4 pueden ser calculadas de acuerdo a: CH4=(a+2b)-CO2 (Blümmel et al 1997; Makkar 2001).
Con base en las leyes generales de los gases de Boyle y Gay-Lussac, el volumen de gas puede ser calculado desde:
PV = nRT
donde:
P= Presión de gas (atm)
V= Volumen de gas (lt)
n Número de moles de gas
R= 0.082, constante molar de un gas a 0ºC y 760 mm de Hg
T= Temperatura absoluta (ºK)
Asumiendo una presión de 1 atm, se estima que una mmol de gas ocupa 25.62 ml, a 39ºC. Si los laboratorios están localizados en áreas donde la presión atmosférica no es 1 atm, el respectivo ajuste debe ser realizado (Williams 2000).
La cantidad de gas producida por gramo de materia seca (MS) o de materia orgánica (MO) desaparecida puede ser calculada si las pérdidas de sustrato son medidas, bien sea a determinados intervalos de tiempo o al final de la fermentación (Williams 2000)
Tres aproximaciones para medir la producción de gas han sido usadas: 1) medir el volumen de gas a presión atmosférica constante, 2) medir la presión de gas a un volumen fijo, y 3) medir el número de incrementos de volumen requeridos para causar un pequeño cambio definido en la presión, una combinación de los métodos 1 y 2. La elección del método para medir la producción de gas depende del supuesto que los excesos de presión acumulada afectan el crecimiento microbiano (Schofield y Pell 1995a) y generan cambios en la solubilidad de los gases en el medio, lo cual puede generar errores en las mediciones (Getachew et al 1998)
Como ejemplos de la primera aproximación está el método manométrico (McBee 1953; Beuvink et al 1992) y el método desarrollado en la Universidad de Höhenheim en Alemania (Menke et al 1979; Menke y Steingass 1988). En el primero se mide la cantidad de agua desplazada debido a la acumulación de gas y, en el segundo se involucra el uso de jeringas de vidrio, en las que el embolo se desplaza en la medida en que la presión de gas incrementa.
La cinética de producción de gas puede medirse de una forma más precisa empleando transductores de presión y variantes del sistema han sido descritos por Pell y Schofield (1993), Theodorou et al (1994), Davies et al (1995) y Cone et al (1996).
En el sistema británico de Theodorou et al (1994), los sustratos se incuban en frascos sellados causando la acumulación de los gases de la fermentación en el espacio superior y un ensamble de jeringa/transductor de presión es usado para medir y liberar el gas acumulado hasta restaurar la presión atmosférica al interior del frasco. Las mediciones de presión acumuladas en el espacio superior son usadas para generar estimados del volumen de gas usando una función cuadrática derivada de mediciones simultáneas de presión y volumen. A diferencia de los sistemas completamente automáticos, que combinan cada botella con su propio transductor de presión, este utiliza un único transductor de presión para todos los frascos de fermentación (Davies et al 1995; Cone et al 1996). Las principales ventajas del sistema son la alta capacidad, el bajo costo, su fácil mantenimiento y su mayor seguridad, ya que en comparación con la técnica de la jeringa (Menke et al 1979) se reducen los errores de operación y medición. Por el hecho de que las mediciones pueden ser tomadas en cortos intervalos, el tiempo de colonización es mejor descrito. Sin embargo, la demanda de frecuentes lecturas durante la fermentación inicial y el hecho de que las mediciones tienen que ser manualmente ingresadas a las hojas de cálculo limitan la capacidad y la seguridad del sistema (Mauricio et al 1999).
El dispositivo automático más tempranamente reportado fue desarrollado por Beuvink et al (1992). Este sistema está basado sobre el peso del fluido desplazado por el gas de fermentación de botellas individuales. El cambio en el peso es registrado y un cálculo para convertir el peso a volumen de gas es realizado (Williams 2000).
Los restantes sistemas automáticos difieren en si los frascos permanecen cerrados y la presión acumulada es registrada (Pell y Schofield 1993) o si los frascos son desahogados de acuerdo a un umbral de presión dado o intervalo de tiempo (Davies et al 1995; Cone et al 1996). Por el hecho de que cada válvula que se abre representa la liberación de una cantidad conocida de gas, el total de gas producido puede ser determinado por la contabilización de las válvulas abiertas (Davies et al 1995).
Una ventaja de los sistemas automáticos es la reducción de la labor, especialmente las primeras 36 horas de incubación donde, debido a la rápida fermentación, frecuentes lecturas son requeridas en los procedimientos manuales (Pell et al 1997). No obstante, el alto costo inicial, la complejidad y los problemas de mantenimiento, hacen de ellos sistemas inapropiados para muchos laboratorios, especialmente en países en desarrollo (Mauricio et al 1999)
La técnica de producción de gas al igual que otros procedimientos de digestibilidad usan sustratos molidos, medio anaeróbico, temperatura de 39ºC e inóculo ruminal (Williams 2000).
El contenido y la naturaleza de varios constituyentes del alimento y por consiguiente, la cinética de fermentación, pueden ser influenciados por la temperatura y el proceso de secado del sustrato. La mayoría de los grupos hacen secado por congelación o en el horno a baja temperatura (60 o 70ºC) (Williams 2000; Rosero 2002).
Un menor tamaño de partícula aumenta el área de superficie para la degradación microbiana. Para el análisis de producción de gas, la mayoría de los autores muelen los sustratos a través de una malla de 1 mm (Williams 2000).
La cantidad de material requerido para evaluar la cinética de fermentación varía desde 0.1 a 1 g (Williams 2000). Con un aumento en el tamaño de la muestra se produce una disminución en la producción de gas por cada gramo de MS, debido a la baja proporción de microorganismos en relación al sustrato o al agotamiento del tampón (Getachew et al 1998).
Todos los medios en uso tienen en común tampón de bicarbonato y fosfato, un agente reductor, una fuente de nitrógeno, varios minerales, y resazurina como indicador de potencial redox. En todos los casos, el CO2 es usado durante la preparación del medio para asegurar un bajo potencial redox al momento de la inoculación, ya que la ausencia de anaerobiosis resulta en pérdidas de bacterias celulolíticas y amilolíticas (Williams 2000). Grant y Mertens (1992b) indican que el gaseo continuo con CO2 y los agentes reductores promueven un menor tiempo de colonización y una más rápida digestión de la FDN.
El fluido ruminal tomado después del ayuno es menos activo que el colectado dos horas después de alimentar, pero es más consistente en su composición y actividad. Como regla general, se recomienda colectar el inóculo antes de la alimentación y de por lo menos tres animales consumiendo la misma dieta. (Williams 2000). La incubación de un mismo sustrato puede conducir a diferente producción de gas si el fluido ruminal es tomado en diferentes días, situación que deberá corregirse por la introducción de estándares de conocida producción de gas (Getachew et al 1998).
El licuado incrementa en el inóculo el número de bacterias previamente adheridas a la fibra, la mayoría celulolíticas, pero también el número de partículas pequeñas del alimento, por lo que la producción de gas en los frascos de incubación y en los blancos se hace mayor (Pell y Schofield 1993). El procedimiento de licuado puede también aumentar el riesgo de exposición al oxígeno si el flujo de CO2 no es suficientemente fuerte (Williams 2000.
Estudios in vitro describen que un medio conteniendo 20 a 25% de fluido ruminal da los mejores resultados (Schofield 2000). Sin embargo, la cantidad de inóculo adicionado varía ampliamente entre grupos (Williams 2000). Algunas proporciones líquido ruminal:tampón son 1:2 (Cone et al 1996; Menke y Steingass 1998); 1:4 (Pell y Schofield 1993), 1:9 (Theodorou et al 1994; Mauricio et al 1999)
Una serie de botellas blanco conteniendo medio e inóculo pero no sustrato, es rutinariamente incluida en cada corrida. El promedio de gas registrado por los blancos, que normalmente corresponde al 13-27% de la lectura final, es substraído desde el total de gas producido por los sustratos evaluados, obteniendo así el total de gas realmente derivado desde la fermentación del sustrato.(Pell y Schofield 1993; Schofield 2000)
Al igual que los blancos, los estándares (tres jeringas con heno, heno+almidón, concentrado) son corridas en cada experimento. Cada estándar tiene una producción de gas conocida, determinada por promedio de muchas réplicas. Si el estándar incluido dentro de una corrida produce entre el 90 y el 110% del gas con respecto al valor promedio, entonces el fluido ruminal es calificado como normal y todas las medidas de volumen de gas son corregidas por el factor "promedio del volumen estándar/volumen estándar de la corrida". Si, por el contrario, el volumen estándar de la corrida está situado por fuera de este rango, el dato de la corrida es desechado (Schofield 2000).
López et al (1998) indicaron que los henos de leguminosas se degradan a una tasa más alta que los henos con una alta participación de gramíneas.
Los datos de producción de gas serían más fácilmente interpretados si un sistema tampón basado únicamente en bicarbonato o fosfato fuera utilizado. Sin embargo, para lograr un pH>6, una mezcla de bicarbonato-fosfato es necesaria (Pell y Schofield 1993).
Los microorganismos ruminales son muy sensibles a cambios en el pH y la mayoría prefieren un rango de pH entre 6.5 a 6.8. Las bacterias celulolíticas, en particular, son más sensibles a bajos pH que las bacterias amilolíticas (Grant y Mertens 1992a) .Hoover et al (1984) demostró que un pH alto (7.5) o bajo (5.5) severamente compromete la digestión de la fibra
Para evitar que factores no fibrosos limiten la fermentación de la fibra, Grant y Mertens (1992b) recomiendan utilizar aditivos nutricionales para asegurar la máxima digestión, especialmente con sustratos bajos en proteína y microminerales
Aunque los protozoarios hacen una significativa contribución a la digestión de la fibra, su remoción permite que más bacterias colonicen las plantas, cubriendo el nicho anteriormente ocupado por ellos, demostrando que la actividad de los protozoarios y de las bacterias parece ser intercambiable. Hidayat et al (1993) señalaron que si todos los nichos de degradación disponibles son colonizados por bacterias o protozoarios, la adición de población complementaria no incrementa la tasa o la extensión de la fermentación.
Borba et al (2000) señalan una posible relación inversa existe entre la producción de gas y el porcentaje de proteína de la dieta del donador.
La actividad microbiana, el volumen de gas y las presiones cambian con la temperatura, por lo que está debe estar en 39°C (Schofield 2000).
El CO2 tiene una fuerte tendencia a formar soluciones supersaturadas en medio acuoso. Si esto ocurre, la presión o el volumen obtenidos en las lecturas serán incorrectos. Afortunadamente esta tendencia puede ser reducida por suave agitación ocasional (Schofield 2000).
El ajuste de los perfiles acumulados de gas a una apropiada ecuación permite resumir la información cinética (Williams 2000). Así, la descripción matemática de las curvas de producción de gas permite la comparación de los sustratos, la evaluación de diferentes ambientes de fermentación y proporciona información sobre la composición del sustrato y las tasas de fermentación de los constituyentes solubles y estructurales (Groot et al 1996; Noguera et al 2004).
Varios modelos están disponibles para la parametrización de los perfiles de degradación (Beuvink y Kogut 1993), todos ellos con ventajas y desventajas de ajuste estadístico uno frente al otro dependiendo de las condiciones experimentales y del tipo de sustrato, lo que hace necesaria su evaluación con el fin de escoger el mejor para cada situación y no la utilización indiscriminada de un único modelo (Noguera et al 2004). La escogencia del modelo no deberá tener solamente en cuenta consideraciones matemáticas, sino también el significado biológico de los parámetros (Williams 2000).
El incremento en la frecuencia de las lecturas de la producción de gas conduce a la obtención de perfiles muy detallados (Williams 2000). Por el hecho de que los perfiles de producción de gas usando jeringas de vidrio o un sistema manométrico son obtenidos con un limitado número de datos, ellos pueden ser descritos por simples modelos exponenciales, basados en cinéticas de primer orden, asumiendo una tasa fraccional constante de fermentación (Groot et al 1996; Cone et al 1997). La introducción de más avanzados y sensibles equipos de producción de gas, tales como los transductores de presión, que cuantifican la cinética de fermentación con una alta precisión, donde diferentes procesos pueden ser identificados, hace necesaria la utilización de modelos multifásicos (Groot et al 1996; Noguera et al 2004). El valor potencial valor de los modelos multifásicos es que separan el sustrato evaluado en las fracciones más rápida y más lentamente fermentables (Williams 2000).
Los perfiles de producción de gas pueden ser descritos por un modelo trifásico (Cone et al 1997). Los componentes solubles son rápidamente fermentados después de la incubación, subsecuentemente, un cambio gradual ocurre hacia la fermentación de las partes insolubles, las cuales necesitan ser hidratadas y colonizadas por los microorganismos ruminales antes de ser fermentadas y por último, el gas se produce por el reciclaje de la población microbiana y no por la fermentación del alimento (Van Milgen et al 1991; Cone et al 1997). Acerca de esta última fase, es conveniente evitar prolongadas fermentaciones después del agotamiento del sustrato, porque la lisis microbiana hace los datos difíciles de interpretar (Stefanon et al 1996).
Un factor que dificulta la descripción matemática de la digestión de las fibras naturales es el hecho de que ellas son una mezcla de componentes, los cuales se digieren a diferentes tasas (Schofield et al 1994). Ha sido propuesto que la digestión de cultivos puros de celulosa ocurre de acuerdo a una cinética de primer orden, la diversidad química y morfológica de los forrajes hace insostenible este supuesto (Van Milgen et al 1991; Schofield et al 1994).
Los constituyentes solubles en detergente neutro (SDN) comprenden azúcares simples y sus polímeros de cadena corta, sustancias pécticas y almidones, además de una fracción no carbohidratada, que incluye proteína, polifenoles solubles, cenizas, ácidos orgánicos y lípidos. Las sustancias SDN juegan un papel importante en las etapas tempranas de la digestión del forraje, el cual llega a ser menos significativo en etapas posteriores (Stefanon et al 1996). Schofield y Pell (1995b) presentaron las curvas de substracción como un método indirecto que provee información sobre el tamaño y la cinética de digestión de la fracción soluble en detergente neutro.
La técnica de producción de gas puede ser empleada en modelos nutricionales como el CNCPS (Russell et al., 1992; Sniffen et al., 1992; Fox et al., 1992) S (Russell et al 1992), que divide los carbohidratos en cuatro fracciones: (A) azúcares y ácidos orgánicos, (B1) almidones y sustancias pécticas, (B2) fibra digestible y (C) residuo indigestible. La contribución de gas de los constituyentes SDN, que en el sistema (Russell et al., 1992; Sniffen et al., 1992; Fox et al., 1992) S corresponde a las fracciones A y B1, puede ser calculada como la diferencia en el volumen de gas producido entre la muestra entera (gas total producido) y su respectiva fibra detergente neutra (FDN o fracción B2) (Schofield y Pell 1995b; Doane et al 1997). Igualmente la fracción A puede ser removida de la muestra por el tratamiento con etanol, la substracción de la curva de digestión del residuo insoluble en etanol (RIE) desde la curva de digestión del material original permite diferenciar la curva de digestión de la fracción A (Rosero 2002) y la substracción de la curva de digestión de la FDN desde la curva de digestión del RIE permite diferenciar la curva de digestión de la fracción B1(Schofield 2000).
Tres consideraciones deben ser realizadas para la utilización de las curvas de digestión de cada una de las fracciones: (1) los tratamientos químicos empleados para obtener la FDN o el RIE no modifican la digestibilidad de estas fracciones, (2) los efectos asociativos entre las diferentes fracciones son ignorados, (3) el tratamiento térmico con detergentes y alcohol no remueve sustancias que puedan inhibir la digestibilidad in vitro (Rosero 2002). En vista de que la varianza de la curva de los constituyentes SDN es la suma de las varianzas para el forraje entero y las mediciones de FDN, hay una relativa acumulación de error en esta curva, lo cual es una inevitable consecuencia de las curvas de substracción (Schofield y Pell 1995b).
La relación de sustrato verdaderamente degradado (mg) a volumen de gas producido (ml) puede reflejar variaciones en la producción de biomasa microbiana, y este coeficiente ha sido definido factor de partición. Este factor disminuye con el tiempo de incubación (López et al 1998), de tal forma que la producción de gas o de AGV y de biomasa microbiana por unidad de sustrato realmente degradado no es una constante y una relación inversa puede existir entre ellos (Naga y Harmeyer 1975; Blümmel et al 1999). La explicación reside en la variación de la producción de biomasa microbiana por unidad de ATP generada (YATP) (Blümmel et al 1997).
El factor de partición puede variar dependiendo de las proporciones molares de AGV (relación acetato a propionato) y YATP. La producción de biomasa microbiana por unidad de ATP puede variar desde 10 hasta 32 mg. A similar YATP, una producción proporcionalmente más alta de propionato conducirá a un mayor factor de partición comparada con una alta producción de acetato (3.0 vs. 2.8 y 3.6 vs. 3.3 a un YATP de 10 y 20, respectivamente) (Getachew et al 1998).
Se sugiere por lo tanto, la combinación de mediciones de gas in vitro con determinaciones del residuo verdaderamente degradado después de varios períodos de incubación (Blümmel et al 1999). El residuo verdaderamente no degradado se obtiene de tratar el residuo obtenido con una solución detergente neutra para remover la biomasa microbiana (Goering y Van Soest 1970).
Los sustratos con una alta degradabilidad verdadera pero, proporcionalmente a la cantidad de sustrato degradado, baja producción de gas presentan más alto factor de partición, mayor consumo de materia seca, más alta biomasa microbiana, más alta eficiencia en la síntesis de proteína microbiana, más baja producción de metano y más baja producción de AGV (Blümmel et al 1999; Makkar 2001).
La relación entre los productos de la fermentación in vitro y el aporte del sustrato puede ser generalizada por tres ecuaciones:
Ecuación 1: Sustrato incubado - Sustrato verdaderamente
degradado = Biomasa microbiana + AGV + Gases
Ecuación 2: Sustrato incubado - Sustrato aparentemente
degradado = AGV + Gases
Ecuación 3: Sustrato verdaderamente degradado - Sustrato
aparentemente degradado = Biomasa microbiana (Blümmel et al
1997).
La producción de biomasa microbiana in vitro (en mg) puede ser calculada como: mg de sustrato realmente degradado - (volumen de gas en ml x factor estequiométrico) (Makkar 2001). Los procedimientos para el cálculo de este factor y la relación entre producción de AGV, producción de ATP y producción de masa microbiana pueden ser obtenidos desde Blümmel et al (1997) y Getachew et al (1998).
Se ha demostrado que la producción de gas está relacionada con la desaparición de la FDN (Nsahlai et al 1995) y al respecto Pell et al (1997) encontraron que la relación entre ambos conceptos es lineal, con una pendiente marcadamente constante. Igualmente se ha encontrado una alta correlación entre la producción de gas in vitro y la disponibilidad del almidón en los granos de cereales (Opatpatanakit et al 1994). Menke et al (1979) encontraron que la producción de gas acumulada en 24 horas estuvo bien correlacionada con la digestibilidad de la MO determinada in vivo. Finalmente, Sileshi et al (1996) y López et al (1998) han reportado significativas correlaciones entre la tasa fraccional de desaparición de la MS in situ y la tasa fraccional de producción de gas.
El sistema de evaluación de la Universidad de Hohenheim combinó el volumen total de gas después de 24 horas de incubación con valores del análisis proximal, a saber, concentración de proteína cruda, grasa cruda, fibra cruda y cenizas, originando una ecuación (R=0.98) para la predicción del contenido de EM (Williams 2000).
La técnica de producción de gas puede ser también usada para determinar la importancia de las diferentes fracciones alimenticias (monosacáridos, pectinas, almidón, celulosa y hemicelulosas) para proveer energía a los microorganismos y para determinar que componentes inhiben la actividad microbiana (Nsahlai et al 1995).
La discrepancia entre los valores estimados de fermentabilidad de los forrajes empleando técnicas in situ e in vitro se presenta por la más baja fermentación de la fibra en el sistema in vitro. Algunas razones que explican esta discrepancia corresponden al hecho que algunas plantas tienen factores antinutricionales que son liberados durante la fermentación y se acumulan en el medio de incubación alcanzando niveles inhibitorios para los microorganismos, en tanto que en la técnica de la bolsa de nylon la toxicidad para los microorganismos o el enlace a sus enzimas es diluido (Williams 2000). Adicionalmente, los métodos basados en determinaciones gravimétricas permiten la solubilización de los factores antinutricionales, por lo que ellos son medidos como MS digestible cuando realmente no hicieron ninguna contribución de energía al sistema. Contrariamente, en la técnica de gas, el efecto de estos principios sobre la fermentación ruminal es reflejada precisamente en la menor producción de gas (Nherera et al 1999).
La técnica de producción de gas permite detectar diferencias entre los sustratos generadas por su madurez, condiciones de crecimiento, especie o cultivar y métodos de preservación. Igualmente ha sido usada para determinar diferencias en la fermentabilidad de los residuos de cosecha sometidos a diversos tratamientos químicos o físicos (Williams 2000).
La técnica tiene potencial para investigar efectos asociativos entre alimentos (Liu et al 2002). El procedimiento consiste en incubar primero las dietas separadamente y posteriormente en combinación, monitoreando la producción de gas. Los trabajos realizados al respecto han observado una interacción positiva en la producción de gas en las etapas tempranas de la incubación (Getachew et al 1998). De lo anterior se desprende que la producción de gas ofrece un medio para investigar las interacciones de las fracciones solubles e insolubles durante la fermentación (Stefanon et al 1996).
La cinética de producción de gas depende de las proporciones de partículas solubles, insolubles pero degradables, y no degradables del alimento (Getachew et al 1998). La sincronización entre la energía y el nitrógeno suplementados en el rumen es una aproximación para mejorar la eficiencia de la fermentación ruminal. Para aplicar este principio en formulación de alimentos, se necesitan datos sobre las tasas de degradación de las proteínas y de fermentación de los carbohidratos. Las técnicas de producción acumulativa de gas pueden ser usadas para generar esta información (Williams 2000). La producción de gas podría también ser potencialmente usada para comparar la cinética de fermentación desde el rumen o el intestino grueso de diferentes especies y/o del resultado de diferentes dietas (Williams et al 1995).
Ørskov et al (1988) mostraron que el consumo de forrajes fue mejor correlacionado con sus características de degradabilidad ruminal que con la digestibilidad en el tracto digestivo total. La técnica de producción de gas ha sido usada como una medida de la degradación ruminal de los alimentos y como un indicador del consumo de MS digestible (Liu et al 2002). De hecho, la tasa fraccional de degradación ha sido un medio para predecir el consumo voluntario de forrajes por los rumiantes (López et al 1998). No obstante, en los intentos que se han realizado para relacionar las tasas de digestión in vitro con el consumo de MS, las correlaciones han sido bajas, porque las variables claramente importantes en regular el consumo tales como el estado fisiológico, el nivel de producción y las condiciones ambientales no son tenidas en cuenta (Pell et al 1997).
La producción de gas desde la FDN está mejor correlacionada con el consumo voluntario que los valores obtenidos desde la incubación del forraje entero (Blümmel y Becker 1997) porque el consumo de pared celular genera distensión ruminal (Rosero 2002).
Las principales ventajas de la técnica de producción acumulativa de gas están dadas por el bienestar animal, tamaño de la muestra, costo y descripción de la cinética de fermentación (Williams 2000).
Una limitación de la técnica es la falta de uniformidad en las metodologías, lo que hace difícil comparar resultados entre grupos de investigación (Williams 2000). Además, como otros métodos de bioensayo, requieren animales fistulados en el rumen para la obtención del inóculo, y la fistulación no solamente incrementa el número de problemas prácticos, como son la facilidad quirúrgica, el constante cuidado para evitar infecciones, particularmente en los trópicos, el costo asociado con el largo término de mantenimiento de esos animales, sino que se trata de un procedimiento invasivo, el cual está en desuso por consideraciones éticas. Hay, por lo tanto, la necesidad de identificar un inóculo alternativo al licor ruminal como fuente de microorganismos y una alternativa consiste en el uso de las heces (Jones y Barnes 1996; Mauricio 1999).
Jones y Barnes (1996) condujeron estudios de digestibilidad de la MS in vitro (DIVMS) de leguminosas tropicales usando fluido ruminal y heces bovinas como fuente de inóculo. Los valores de DIVMS desde el fluido fecal fueron linealmente correlacionados con aquellos obtenidos con fluido ruminal (r=0.98; p<0.001), pero el fluido fecal dio significativamente (p<0.001) más bajos valores de digestibilidad
Experimentos realizadas por Mauricio et al (1998; 2001) con el fin de comparar líquido ruminal y heces como fuente de inóculo, mostraron que con la materia fecal se obtuvo mayores tiempos de colonización y una menor capacidad de fermentación, lo que posiblemente se deba a una menor actividad microbiana porque los microorganismos son originados principalmente en el ciego y el colon. La reducida fermentación en el ciego y el colon con respecto a la que ocurre en el rumen puede ser una combinación de diferentes factores, entre ellos, sustratos de más bajo valor nutritivo y más corto tiempo de retención, dando como resultado una más baja población de bacterias comparada con el líquido ruminal. La diferencia en la tasa de producción de gas entre el líquido ruminal y las heces también puede ser explicada por la diversidad de microorganismos presentes, ya que estudios preliminares han sugerido que el rango en el intestino grueso, y por lo tanto en las heces, parece ser menos diverso que en el contenido ruminal. En conclusión, como las diferencias entre ambos inóculos son debidas al menor tamaño y actividad de la población microbiana de las heces, el uso de un inóculo más concentrado o de mayor cantidad de inóculo fecal y el mejoramiento de la actividad fermentativa de los organismos fecales merece más investigación (Mauricio et al 1998; Mauricio et al 2001).
El mayor limitante en la producción bovina de los países en desarrollo es la fluctuación en la cantidad y calidad de los recursos forrajeros, por tanto la descripción de los alimentos en términos de la cinética de digestión provee una base útil para su evaluación y eficiente utilización.
La sincronización entre la energía y el nitrógeno suplementados en el rumen es una aproximación para mejorar la eficiencia de la fermentación. Para aplicar este concepto en la formulación de raciones, siguiendo los lineamientos de los nuevos programas de evaluación (Russell et al 1992; Sniffen et al 1992; Fox et al 1992) se requieren datos sobre la dinámica digestiva, los cuales pueden ser obtenidos desde la técnica de producción de gases. En vista de que la técnica permite estudiar la interacción entre diferentes alimentos, ella puede ser empleada para evaluar como la inclusión de suplementos energéticos y proteicos, tales como alimentos concentrados y árboles forrajeros, mejoran las características de degradación de la dieta básica.
La técnica de producción de gases, a diferencia de otras técnicas in vitro e in situ, ofrece la posibilidad de establecer el curso y la importancia de la fracción soluble del sustrato dentro del proceso fermentativo; además de determinar de una forma más precisa el efecto de los principios antinutricionales.
El uso potencial de las heces como fuente alternativa de inóculo evita el empleo de animales fistulados, permitiendo la caracterización de los recursos alimenticios en las condiciones propias de cada explotación ganadera.
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Received 3 December 2004; Accepted 27 December 2004; Published 1 April 2005