Sustancias antinutricionales en las hojas de guamo, nacedero y matarraton

Walter F Galindo*, Mauricio Rosales*, Enrique Murgueitio* y Jesús E Larrahondo**

*Fundación CIPAV, Apartado Aéreo 20591, Cali, Colombia;
**CENICAÑA, Apartado Aéreo 9138, Cali, Colombia

Foliages from three forage trees (Inga spectabilis, Trichantera gigantea and Gliricidia sepium). were analysed for their contents of major minerals and anti-nutritional compounds (phenols, alkaloids, saponins and steroids). A feeding trial was carried out with goats fed the forage from Inga spectabilis.

The Inga foliage had highest contents of phenols and steroids, with Trichantera having the least. Alkaloids were not detected in any of the forages, and saponin content was low. Dry matter degradability in nylon bags in the rumen was highest for Trichantera (77% at 48h), followed by Gliricidia (70%) with Inga being the poorest (33% at 48h).

Heart rate decreased and respiratory rate increased markedly in goats fed exclusively on foliage from Inga.

Key words: Goats, Inga spectabilis, Trichantera gigantea, Gliricidia sepium, toxicity, alkaloids, phenols, saponins, steroids, rumen degradability, trees, forage.

El experimento consistió en la evaluación fitoquímica de tres árboles forrajeros: Guamo (Inga spectabilis), Nacedero (Trichantera gigantea) y Matarratón (Gliricidia sepium). El estudio incluyó también un ensayo biológico realizado en el aprisco Los Cantiles, en la Cumbre (Valle). El objetivo fué hacer un estudio de tres árboles forrajeros diferentes y establecer un cuadro comparativo de su composición de minerales y compuestos antinutricionales (fenoles, alcaloides, saponinas y esteroides). Los resultados obtenidos para alcaloides fueron negativos para los tres forrajes y las saponinas resultaron bajas en su contenido, por lo que se consideró que no afectarían la salud de las cabras. El Guamo consiguió los valores más altos en cuanto a su contenido de fenoles y esteroides con respecto a los otros dos. Los contenidos de fenoles de la hoja de Guamo superaron 15 veces los del Nacedero y 9 los del Matarratón. Esto incidió en la degradabilidad de la materia seca en bolsas en el rumen para el caso del Guamo que sólo alcanzó el 33% a las 48 horas, mientras que el Nacedero y el Matarratón consiguieron el 77 y 70% respectivamente a la misma hora.

Los contenidos de esteroides presentes en los tres árboles resultaron ser muy similares y en poca cantidad, por lo que se considera no ser los causantes de intoxicación al no presentarse sintomatología característica de este fenómeno. Para la identificación del tipo de fenoles de la hoja de Guamo se realizaron pruebas cromatográficas de capa delgada donde se identificaron tres tipos: chalconas, flavonas e isoflavonas. En el ensayo biológico se utilizaron tres cabras criollas de 2.5 años de edad, a cada una de las cuales se le asignó un tratamiento donde se hizo un seguimiento a los cambios de frecuencia cardiaca, respiratoria y temperatura rectal. Los tratamientos fueron: G: alimentación exclusiva con hoja de Guamo. FG: alimentación normal (pasto de corte) más 2 litros de la fracción volátil de la hoja de Guamo. T: alimentación normal como testigo. La duración del ensayo fué de 4 horas durante las cuales la temperatura rectal permaneció constante para las tres cabras. La frecuencia cardíaca de T1 decreció notablemente, resultando una diferencia de 40 pulsaciones por minuto con respecto al testigo, lo que explica el cambio de la frecuencia respiratoria a partir de la tercera hora en la que tuvo que aumentarla para mejorar su oxigenación. La frecuencia cardíaca de T2 siguió la tendencia de la testigo aunque mostró un ligero incremento en la primera hora, debido a la rápida ingestión de fenoles en la solución líquida.

Palabras claves: Fenoles, saponinas, esteroides, alcaloides, degradabilidad, Matarratón, Nacedero, Guamo, cabras, toxicity.

En el trópico los árboles leguminosos han jugado un papel importante al proveer sombra a las plantaciones de café, como barreras vivas, combustible y más recientemente para ser usados en la nutrición animal (Preston y Murgueitio 1987). Una de las características de las leguminosas arbóreas utilizadas como árboles forrajeros es la de recircular, a través de su metabolismo, cantidades altas de nitrógeno y la presencia de proteína que al estar enlazada a compuestos químicos, especialmente a compuestos de tipo fenólico, permite escapar a la degradación ruminal (proteína sobrepasante) y ser fuente importante de proteína de alta calidad biológica para rumiantes (Preston y Leng 1989).

En la zona tropical, especialmente en Africa y Asia, se está trabajando en el desarrollo de sistemas de alimentación que aprovechan el hábito de ramoneo de las cabras; suplementando la dieta con hojas de árboles, que tengan un alto nivel protéico. Es así como en Nigeria utilizan hojas de Gliricidia sp y Leucaena sp. En las Islas Salomón, se trabaja con pasto Elefante y hojas de Leucaena sp. En Indonesia las hojas de Musa paradisiaca, Mangifera indica, Carica papaya y Datura fastuosa, contribuyen en un alto porcentaje al balanceo de las dietas para cabras (Copland 1986).

Las primeras especies que se están utilizando en Colombia son: Acacia forrajera (Leucaena leucocephala), Matarratón (Gliricidia sepium), Cachimbo (Erythina poeppigiana), Nacedero (Trichantera gigantea), Algarrobo forrajero (Prosopis juliflora), Guácimo (Guazuma ulmifolia), Samán (Samanea saman), Totumo (Crecentia cojute), Algarrobo pecueco (Hymenea coubaril) y Caña fístulo (Cassia grandis) (Murgueitio 1988). En Colombia, el Guamo (Inga spectabilis) produce más del 30% de los taninos usados para curtiembre de cueros y maderas; aunque no se reporta su uso en la nutrición animal (Torres 1986).

Las plantas poseen más de 1200 clases de metabolitos secundarios muchos de los cuales les sirven como medio de defensa. Estas barreras para los consumidores son de dos tipos: compuestos que inhiben la digestión, compuestos de efecto tóxico sobre el animal y precursores de compuestos antinutricionales. Por lo anterior, los fenoles son probablemente una defensa muy efectiva contra el ramoneo. El efecto permanece aún después de remover la mayor parte de sustancias solubles en un extracto fenólico. El efecto de éste extracto se manifiesta rápidamente y dura 6 horas (Palo 1987).

Los Flavonoides son usados para tratamientos terapéuticos. Las Flavonas causan un efecto de doble fase en el corazón de las ranas: un efecto negativo inicial seguido de un efecto extendido. Las Flavonas tienen una principal acción estrogénica pero manifiesta un efecto cardíaco depresivo tóxico (Farkas 1975).

Se estudiaron hojas de Guamo (Inga spectabilis), Nacedero (Trichantera gigantea) y Matarratón (Gliricidia sepium). Estos dos últimos se incluyeron en el experimento como un patrón de referencia frente a la hoja de Guamo, ya que en observaciones anteriores se demostró que ésta podría presentar factores antinutricionales que afectan la salud de los animales (Galindo y Rosales 1988); mientras que los otros dos demostraron ser excelentes forrajes.

Estos análisis fueron hechos siguiendo los métodos propuestos por Calero et al (1983).

La degradabilidad de la materia seca fué determinada utilizando la técnica de la bolsa de nylon (Orskov et al 1980). El patrón de referencia usado fué la cascarilla de soya.

Se tomaron 10 g de la muestra a analizar en un mortero y se añadieron 30 ml de éter de petróleo y 30 ml de una mezcla de 9:1 de metanol-agua. Se maceró la muestra. Posteriormente en un embudo de separación se dejó en reposo hasta la formación de dos capas. La capa del fondo es la formada por metanol-agua y es la fracción polar. La capa no polar es la conformada por el éter. Se separaron las dos capas mediante el embudo.

Estas pruebas rápidas para forrajes consisten en la evaluación cualitativa (por cambios de coloración) de la presencia de factores antinutricionales como son los fenoles, esteroides, alcaloides y saponinas (Larrahondo 1985).

Saponinas: Se tomó 1 ml de la fracción de metanol y se añadieron 9 ml de agua. Se filtró la solución. Se tomó 1 ml de este filtrado en un tubo de prueba pequeño, se agitó vigorosamente por 30 segundos y se dejó en reposo durante 15 minutos. La espuma sobrenadante indica la presencia de saponinas en el forraje. La proporción de saponinas se midió de acuerdo a la altura de la espuma sobrenadante:

Altura de menos de 5mm = prueba negativa.
Altura de 5-9mm = contenido bajo.
Altura de 10-14mm = contenido moderado
Altura mayor de 15mm = contenido alto.

Fenoles: Se tomaron unas gotas de la fracción metanólica y se repartieron en un platillo de pruebas de cerámica con cinco compartimientos , añadiendo unas gotas de agua destilada con lo que se logró un color amarillo. Se dejó un testigo y se fue adicionando una gota de cloruro férrico en el segundo, dos en la tercera y así sucesivamente hasta llegar al quinto compartimiento. La caracterización de fenoles se hace de acuerdo a la coloración así:

Ninguna reacción (no cambia de color) = no hay presencia de fenole o taninos.
Cambio en el color azúl oscuro = fenoles o taninos pirogálicos (hidrosolubles).
Cambio de color a verde oscuro = fenoles o taninos de tipo catecol (flavonoides o taninos concentrados).

Esteroides (prueba de Lieberman-Buchard): Se colocó aproximadamente 1 ml de la fracción no polar (capa de eter de petróleo) en un crisol; se evaporó casi hasta la sequedad y se adicionaron 3-4 gotas de cloroformo. Se repartió la mezcla en el platillo de pruebas, se secó al aire y se adicionaron gotas de anhídrido acético seguido por una gota de ácido sulfúrico concentrado (Ver anexo 1). Los cambios de color indican:

Azúl o verde = esteroides
Rojo, rosado o violeta = triterpenos
Amarillo pálido = esteroides o triterpenos saturados.

Alcaloides (prueba de Dragendorff): Se tomaron 3 ml de la solución de metanol-agua (fracción polar) adicionándole 4 gotas de amoníaco. Esta solución se evaporó casi a sequedad para obtener un mínimo residuo. A este último se adicionaron 3 gotas de ácido acético y una gota de agua destilada concentrando la solución en una plancha eléctrica. Se colocaron gotas de esta solución en un papel de filtro y se cubrió con gotas del reactivo de Dragendorff (Anexo 1).

Los ánalisis cuantitativos de fenoles, alcaloides y esteroides se efectuaron mediante métodos colorimétricos utilizando un espectrofotómetro UV/UIS.

Fenoles: Para cuantificar fenoles se realizó el siguiente procedi- miento. Se elaboró una curva o gráfica de absorvancia contra concentración (0, 5, 10, 25, 50 ppm), utilizando una solución patrón de ácido caféico de 200 ppm ( Larrahondo 1980). Se tomaron 100 g de la planta fresca adicionando alcohol (96%) hasta cubrir la muestra. El solvente se dejó en reposo por 4 días. Posteriormente se concentró el extracto de la muestra en un rotoevaporador. El residuo obtenido se disolvió en una mezcla de alcohol-agua (1:1).

Se llevó la solución hasta un volumen de 50 ml con agua, posteriormente se tomaron 2ml de la solución anterior y se llevó a un volumen de 100 ml de agua destilada. A 2 ml de la solución finalmente obtenida se agregaron 0.5 ml del reactivo de Folin 2N, y 0.4ml de una solución de NaOH 0.2N. Simultáneamente se tomaron 2 ml de la solución patrón de ácido caféico y se le adicionaron 0.5 ml del reactivo de Folin y 0.4 ml de la solución 2N de NaOH. Se agitó por 5 minutos. Posteriormente se leyó la absorvancia en un espectrofotómetro a 650 nm.

Esteroides: Se efectuó tomando 1 ml de éter de petróleo separado durante las pruebas rápidas. Se evaporó este extracto en un baño maría. Se pesó la muestra y el concentrado se llevó a 100 ml. Una vez realizada la dilución se tomó 1ml de la solución y adicionaron 0.5 ml del reactivo de Lieberman-buchard (Ver anexo 1). Los resultados se leyeron en una curva de absorvancia contra concentración utilizando una solución patrón de colesterol al 0.4% (AOAC 1970).

La identificación de fenoles presentes en el forraje se realizó mediante cromatografía de capa delgada (TLC).

Se tomó la fracción de metanol-agua obtenida en las pruebas preliminares, se concentró en un rotoevaporador y se efectuó una cromatografía de columna de Sephadex LH20. Se utilizó como fase móvil metanol y gradientes de elución de 80 y 90% de agua. Se obtuvieron 12 fracciones.

Se visualizaron los componentes separados en TLC mediante luz ultravioleta (longitud de onda corta y larga). Además, la fracción metanólica obtenida de la cromatografía de columnna de Guamo se purificó mediante TLC preparativa (Sílice-gel 60), separándose un producto principal el cual se analizó en el espectrofotómetro. Debido a la poca cantidad de muestra no se pudieron efectuar otras determinaciones.

Para determinar la toxicidad de la hoja de Guamo se diseñó un ensayo biológico que incluyó tres cabras criollas de 2.5 años de edad, a las cuales se les suministró las siguientes tratamientos:

G: Alimentación exclusiva con hoja de Guamo.
GF: Alimentación normal (pasto de corte) durante el mismo período más dos (2) litros de extracto de la fracción volátil de hoja de Guamo, la cual tenía una concentración de 2000 ppm de fenoles.
T: Alimentación con pasto de corte como testigo durante las mismas 4 horas.

El extracto de la fracción volátil fué obtenida mediante extraccíón por arrastre de vapor (Larrahondo 1980).

El objetivo del ensayo fué determinar la toxicidad de la hoja de Guamo y/o de la fracción volátil para comprobar los resultados obtenidos en los tres experimentos anteriores y determinar si es posible aplicar algún tratamiento previo al forraje para suministrarlo sin peligro a los animales.

Se tomaron las variaciones de temparatura rectal y frecuencia respiratoria como indicativos de toxicidad a las 0, 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. También se hicieron observaciones de la mucosa en los ojos (miasis, midriasis y secreciones oculares); de la mucosa nasal; de la salivación; tórax , abdomen y palpación del riñon e hígado.

Los resultados de minerales obtenidos para los tres árboles forrajeros se presentan en el Cuadro 1.

Cuadro 1: Contenido de minerales y de nitrógeno en el follaje de los tres árboles forrajeros (porcentaje de la materia seca).

	Nacedero	Matarratón	Guamo

N total (% en la MS)	2.44	2.6	3.74
Fósforo	0.26	0.34	0.10
Potasio	3.18	2.42	0.59
Calcio	3.8	2.4	0.13
Magnesio	1.14	0.41	0.12

En contenido de minerales, es bien inferior el follaje de guamo en comparación con el de nacedero y de matarratón.

Estas pruebas de tipo cualitativo dan idea al investigador de la presencia de compuestos antinutricionales presentes en los forrajes, para posteriormente realizar pruebas cuantitativas de los compuestos encontrados. Esta prueba por ser sencilla, puede hacerse incluso a nivel de campo (Ver Cuadro 2).

Cuadro 2: Pruebas fitoquimicas preliminares

	Nacedero	Matarratón	Guamo

Fenoles	*	*	***
Esteroides	**	*	***
Alcaloides	-	-	-
Saponinas	Bajo	Moderado	Moderado

Se observa que el Guamo tiene probablemente un contenido mucho mayor de fenoles o taninos y esteroides que los otros dos, por lo que se hace necesario hacer una cuantificación de estos compuestos.

Las pruebas cuantitativas de alcaloides y saponinas se descartaron para las tres hojas, ya que la prueba inicial dió negativa para alcaloides y el contenido de saponinas no fué tan alto para que afectara la salud del animal y además, la sintomatología que manifiesta intoxicación no se presentó en pruebas anteriores.

La degradabilidad de la materia seca de los tres forrajes a las 12, 24 y 48 horas se observa en el Cuadro 3.

Cuadro 3: Degradabilidad de la materia seca de las hojas procedentes de tres arboles forrajeros (MS %).

	Guamo	Matarratón	Nacedero

Degradabilidad de la MS (%):
12hr	29.2	36.0	52.4
24hr	34.4	50.0	70.0
48hr	33.8	70.0	77.2

Tanto las hojas de Matarratón como las de Nacedero presentan una alta tasa de degradabilidad, siendo superior el último. En el caso de la hoja de Guamo, la degradabilidad de la materia seca es demasiado baja, lo que indica que las bacterias ruminales no la pueden degradar. La cantidad de proteína que sobrepasa es posible que no sea aprovechada por el animal, si ésta va ligada con taninos formando compuestos totalmente insolubles.

Los resultados de las pruebas cuantitativas se observan en el Cuadro 4. Los contenidos de fenoles de la hoja de Guamo superan al Nacedero 9 veces y al Matarratón 15.

Cuadro 4: Compuestos antinutricionales presentes en tres árboles forrajeros (% en base fresca)

	Guamo	Matarratón	Nacedero

Fenoles (ppm)*	370	260	450
Esteroides (%)**	0.062	0.017	0.062

El contenido de esteroides mostrado en el Cuadro 4 confirma los resultados obtenidos en las pruebas preliminares, donde se evidencia un contenido mayor de esteroides en la hoja de Guamo pero que no difiere mucho su contenido en las otras hojas. Es probable que la proporción de esteroides en los tres forrajes no sea de importancia para su uso en dietas de animales.

Los resultados de TLC para fenoles mostraron la presencia de Chalconas (2-4 OH libres), Isoflavonas (sin 5-OH libres) y Flavonas (con 5-OH ó 3-OH sustituídos). Estos son algunos de los tipos de fenoles identificados sin descartar la presencia de otros como Taninos condensados que de hecho contiene, ya que el Guamo produce el 30% de Taninos.

Las Flavonas asociadas a Taninos y Polifenoles inhiben la digestión además que forman complejos insolubles con la proteína. Esta caracterización química solo se hizo para fenoles de la hoja de Guamo debido a la gran cantidad de los mismos y por que además fué el forraje utilizado en los experimentos con los animales.

Los resultados de esta prueba con animales se resumen en el Cuadro 5. Las variaciones de temperatura rectal de las cabras pueden considerarse como relativamente invariables ya que en ningún caso fueron mayores de 0.5°C. Las curvas de la cabra testigo y de la que se le suminstró el extracto fenólico tienen la misma tendencia; aquella que consumió hoja de Guamo presenta algunas variaciones, pero como se dijo anteriormente no se considera que esté influenciada por el tratamiento.

Las variaciones de la frecuencia respiratoria de por sí no indican mucho, debido a que deben analizarse conjuntamente con las variaciones de la frecuencia cardíaca, la cual mostró más directamente los efectos de los tratamientos.

Cuadro 5: La temperatura rectal (°C), frecuencia cardiaca (pulsaciones/min) y frecuencia respiratoria (inspiraciones/min) en cabras criollas de 2.5 años

Horas:	0	0.5	1	1.5	2	3	4

G: (Guamo)
T °C	39.6	39.5	39.4	39.3	39.5	39.8	39.2
Frec card	104	97	92	88	84	80	76
Fre resp	24	31	37	40	40	32	40

GF: Extracto Guamo
T °C	39.2	39.4	39.5	39.4	39.3	39.2	39.1
Frec card	112	124	128	122	113	104	112
Frec resp	32	40	52	51	43	32	28

T: Testigo
T °C	38.9	39	39	39	39	39	38.5
Frec card	112	113	116	115	113	112	108
Frec resp	32	40	44	42	36	28	28

El ritmo cardíaco de la cabra que consumió la hoja de Guamo decreció notablemente hasta llegar solo a 76 pulsaciones por minuto a las cuatro horas lo que indica una variación de 40 pulsaciones (30%) menos que la cabra testigo (Cuadro 5). Esto explica el cambio de la frecuencia respiratoria a partir de las tres horas ya que tuvo que aumentar su frecuencia respiratoria para mejorar su oxigenación. Por todo lo anterior se puede decir que hay intoxicación debido muy probablemente a Flavonas e Isoflavonas.

Podría pensarse que este cuadro toxicológico se debe a esteroides, pero esta posibilidad se descarta ya que no se presentaron otros síntomas de intoxicación por estos compuestos (salivación y vómitos).

La frecuencia cardíaca de la cabra a la que se le suministró el extracto fenólico de la hoja de Guamo, difiere de la testigo pero trata de seguir su tendencia. Considerándola con respecto a la del animal que consumió hoja de Guamo, las tendencias son totalmente opuestas. El extracto volátil tiende a incrementar el ritmo cardiáco mientras que la hoja de Guamo lo decrece. Esto puede explicarse debido a que en las plantas pueden encontrarse al mismo tiempo metabolitos secundarios responsables de efectos opuestos en el metabolismo animal. Existe de todas maneras una intoxicación debido al extracto fenólico que se manifestó rápidamente hasta la primera hora y que luego tendió a disminuir, notándose su efecto hasta la cuarta hora de haber iniciado el experimento. En el extracto posiblemente existen compuestos fenólicos que tengan un efecto inotrópico de aumento de la frecuencia. No se encontraron variaciones en ninguna de las demás variables estudiadas para ninguno de los tratamientos.

Es importante, cuando se trata de dietas tropicales con base en árboles forrajeros, determinar por lo menos la presencia de compuestos antinutricionales como son fenoles, saponinas, alcaloides y esteroides; mediante pruebas rápidas con base en cambios de coloración.

Las pruebas rápidas para la determinación de factores antinu- tricionales demostraron corresponder perfectamente con las pruebas cuantitativas, por lo que se recomienda su uso con toda seguridad, ya que pueden hacerse incluso a nivel de campo, con un sencillo equipo.

La hoja de Guamo, contrario a los otros dos forrajes, tiene bajos contenidos de minerales (de valor nutricional) y altas cantidades de sustancias antinutricionales, especialmente fenoles.

Considerando todos los análisis químicos realizados, la hoja de Matarratón es el mejor forraje para dietas tropicales, por que presenta los compuestos nutricionales más altos, una buena tasa de degradabilidad y los principios tóxicos más bajos que los otros forrajes estudiados.

La hoja de Nacedero contiene altos niveles de Ca y P, lo que la hace ideal para animales en lactancia, además por sus componen- tes químicos puede considerarse como un forraje apto para dietas tropicales en zonas donde no se produzca Matarratón.

Cuando la hoja de Guamo es suministrada al animal, éste presenta un cuadro toxicológico agudo que se manifiesta en su frecuencia respiratoria y cardíaca, debido a su alto contenido de fenoles. El extracto fenólico volátil de la hoja de Guamo tiene también un efecto tóxico agudo sobre el animal, pero contrario al efecto de la hoja, además que no es tan grave.

Suministrando la hoja seca de Guamo seca de tal manera que la fracción volátil se haya evaporado, es posible que no sea tan grave el efecto tóxico.

Se demuestra así mismo que la baja tasa de degradabilidad de la hoja de Guamo, probablamente debida a su contenido de fenoles, afecta la degradabilidad de sus principios alimenticios, además de presentar un efecto cardiotóxico en los animales.

AOAC 1970 1970 Oficial methods of analyses. Association of Analytical Chemists Washington, DC 1025 pp

Calero S, Larrahondo J y Yang S 1983 Determinación de elementos en tejidos foliares de caña de azúcar utilizando la extracción tricloroacética y agentes orgánicos quelantes. CENICAÑA. Dt N 29, 24 pp

Copland J W 1986 Goat production and research in the tropics. Australian Centre for International Agricultural Research ACIAR Proceedings No 16 Queensland 198 pp

Farkas L y Garbor M 1975 Topics in flavonoids; chemistry and biochemistry. Elseviere Scientific Publishing: Amsterdam pp266

Galindo W y Rosales M 1988 Aportes al desarrollo de un sistema de alimentación para cabras en el trópico. Tesis de grado Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Ciencias Agropecuarias: Palmira

Larrahondo J E 1985 Productos naturales: pruebas químicas iniciales en una planta. Guía de estudio del Departamento de Química, Universidad del Valle 1985 10 pp

Larrahondo J E 1980 Plantas antitumores: constituyentes de la Nectaria rigida. Natural products Vol 43 (353)

Murgueitio E 1988 Los árboles forrajeros en la alimentación animal. Memorias del Primer Seminario de Biotecnología CVC Cali pp5-9

Orskov E R, Hovell F D DeB and Mould F 1980 The use of the nylon bag technique for the evaluation of feedstuffs. Tropical Animal Production 5:195-213

Palo R T 1987 Phenols as defensive compunds in Birch (Betula sp) implications for digestion and metabolism in browsing mammals Uppsala Sweden. Sveriges Lantbruks universitet 110 p

Preston T R y Leng R A 1989 Ajustando los sistemas de produccion pecuaria a los recursos disponibles; aspectos basicos y aplicados del nuevo enfoque sobre la nutricion de los rumiantes en el tropico. CONDRIT Ltda: Cali, Colombia pp312

Preston T R and Murgueitio E 1987 Tree and shrub legumes as protein sources for livestock In: Forage legumes and other local protein sources as substitutes for imported protein meals (Editor: D Walmsley) CTA:Wageningen and CARDI:Trinidad pp94- 104

Torres R Jorge H 1986 Plantas tánicas en Colombia. Bogotá Univer- sidad Nacional de Colombia - Colciencias 176 p

Anexo 1. Reactivos de Lieberman-Buchard y Dragendorff para la evaluación de esteroides y alcaloides.

La reacción de un esteroide disuelto en un solvente apropiado (cloroformo) con una mezcla de ácido sulfúrico y anhidro acético se conoce como la reacción de Lieberman-Buchard. El desarrollo del color e intensidad dependen del compuesto que se ensaya. Generalmente se admite como prueba positiva un color azúl o verde (excepcionalmente un color púrpura), y su absorción máxima en la región visible está entre 600 - 700 nm.

El reactivo consiste en una mezcla 19:1 de anhidro acético y ácido sulfúrico. Para el ensayo se coloca 1 ml de reactivo y se agrega 0.5 ml de la solución esteroidal en ácido acético glacial; la lectura se efectúa después de 30 minutos y de 18-22 °C. Se calcula el valor de absorvancia que corresponde a la concentración de esteroides, con una curva de calibración efectuada con una solución de colesterol.

Solución a: 0.85 g de subnitrato de bismuto disueltos en una mezcla de ácido acético y 40 ml de agua.

Solución b: 8 g de yoduro de potasio disueltos en 20 ml de agua. Antes de usarse se mezclan 5 ml de solución a en 5 ml de solución b y se añaden 20 ml de ácido acético y luego agua hasta 100 ml.

Mezcla: 5 ml de A más 5 ml de B y 20 ml de ácido acético y se lleva a 100 ml con agua destilada.