Cultivo de Spirulina maxima para suplementación proteica

Experiments were carried out in the Instituto Mayor Campesino (IMCA), Buga, Valle (Mean temperature 21°C; 1000 m above sea level), to evaluate local sources of media for the culture of Spirulina maxima. Biodigester and distillery effluents were compared at dilutions (volumes effluent:water) of 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0. An inoculum of spirulina (aproximately 192 cells/ml) was added at the rate of 200 ml per 1,000 ml of media. The treatments for the distillery effluent were: 0.5:0.5, 0.6:0.4 and 0.7:0.3 (effluent:water). Sodium bicarbonate was added in concentrations of 17 and 34 g/litre of media for the biodigester and distillery effluent treatments, respectively. The media were cultured in rectangular glass containers and agitated by bubbling air with a micro-compressor.

Fastest growth of the culture was with dilutions of 0.5:0.5 volumes of effluent:water for both substrates. Concentrations of spirulina cells were 530, 1380 and 9500/ml after 2, 15 and 30 days of incubation with biodigester effluent. Corresponding values for distillery effluent were 1170, 2190 and 10,460.

Major contaminants in the biodigester effluent media were Chlorella, Amoeba and Paramecium spp. The temperature of the media ranged from 23 to 29°C, but appeared to have no marked effect on the growth rate of the spirulina.

Key words: Spirulina, biodigester, distillery, effluent, protein, animal, bicarbonate, culture.

En el Instituto Mayor Campesino en Buga con una temperatura de 21°C y una altura de 1000 msnm, se llevaron a cabo ensayos para evaluar medios de cultivo apropiados para la cianobacteria Spirulina maxima usando efluente de biodigestores y vinaza, desecho proveniente de la fermentación alcohólica de las mieles después de la adición de ácido sulfúrico, suplementando con bicarbonato de sodio para cumplir los requerimientos en carbono y estabilizar el pH. En primera instancia se reprodujo la semilla en medio químico con un tiempo de doblaje de biomasa de 20 a 30 días. Luego se realizaron ensayos usando proporciones (volúmenes) de efluente: agua de 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0. A estas mezclas se agregó un inóculo de spirulina en proporciones de 200 ml de inóculo por cada litro de la mezcla. El inóculo contenía 192 células/ml, dando así una concentración inicial de células en los distintos medios de aproximadamente 32 células por ml. Para la vinaza, las proporciones (vinaza:agua) fueron: 0.5:0.5, 0.6:0.4 y 0.7:0.3, agregándose las mismas cantidades de inóculo de spirulina. Para el efluente de biodigestor se agregó 17 g de bicarbonato de sodio por litro del medio; y en el caso de la vinaza 34 g de bicarbonato. Los medios se colocaron en estanques rectangulares de vidrio, y fueron agitados con aire de un microcompresor.

Se obtuvo la mayor tasa de reproducción del cultivo con el tratamiento de 0.5:0.5 (efluente:agua) tanto para el del biodigestor como el de la destilería. Las lecturas fueron 530, 1380 y 9500 células/ml a los 2, 15 y 30 días después. Los valores correspondientes para la vinaza fueron 1170, 2190 y 10,460 respectivamente. La mayor contaminación que presentó el cultivo fue debida a Chlorella sp. y protozoarios como Amoeba sp. y Paramecium sp. Los cambios de temperatura registrados entre el dia y la noche fueron considerables (desde 23 a 29°C), pero al parecer no afectaron significativamente el desarrollo del cultivo.

Palabras claves: Spirulina maxima, cultivo, efluente, vinaza, bicarbonato de sodio.

La falta de fuentes proteicas que puedan reemplazar los concentrados con altos costos de adquisición en el mercado para los pequeños productores, llevó a considerar la Spirulina maxima como una fuente alternativa con alto contenido proteico (65%) y con un balance de aminoácidos excelente, aunque con un contenido bajo en metionina para usarlo en la alimentación animal, especialmente en monogástricos.

En países desarrollados como México, EEUU y Japón la Spirulina maxima es usada en la alimentación humana para suplir la deficiencia de proteína, pero con sistemas de producción, cosecha y secado muy tecnificados y costosos (Shelef y Soeber 1980). Se han logrado producciones máximas de hasta 120 toneladas/ha/año con un promedio en contenido de proteína del 50% y en sistemas de producción para nutrición en cerdos se han obtenido entre 14 y 34 gr/m²/día (Lincoln 1985).

Se ha empleado en la alimentación de animales, humanos, en acuacultura para la cría de microcrustáceos, para tratamiento de aguas residuales y como fuente energética, además de contribuir a la eliminación de desechos.

La Spirulina maxima, una cianobacteria comúnmente considerada como una microalga por su estructura filamentosa, pertenece al grupo de las cianobacterias no heterocísticas del género de las Oscillatoriaceae (Hargaravez y Viquez 1982). Se considera como un tricoma helicoidal de forma cilíndrica e inmóvil, cuya reproducción se realiza por ruptura intracelular. Su talla oscila entre 13 y 25 micras.

La asimilación de dióxido de carbono se hace a través del ciclo de Calvin, con formación de glucógeno como material de reserva. La espirulina es capaz de realizar la fotosíntesis oxigénica y de fijar el nitrógeno del medio. Puede crecer en medios minerales que tengan CO₂ como fuente de carbono y N₂ como fuente de nitrógeno a partir de desechos, nitrógeno atmosférico o de la respiración bacteriana (Lincoln 1985). Esta cianobacteria presenta un alto contenido de proteína (50% a 65%) con todos los aminoácidos esenciales que se requieren nutricionalmente según la FAO, pero con contenido bajo en metionina (Kosaric et al 1974), como puede observarse en el Cuadro 1.

Cuadro 1: Contenido de aminoácidos de la Spirulina maxima

Amino ácidos	* Datos FAO	* Medio Sintético	* Efluente

Isoleucina	4.2	5.8	6.7
Leucina	4.8	9.3	9.2
Lisina	4.2	5.0	4.6
Fenilalanina	2.8	4.0	4.4
Metionina	2.2	2.2	2.1
Treonina	2.8	4.9	5.3
Triptófano	1.4	nr	nr
Valina	4.2	6.9	6.6

Comparativamente con otros microorganismos como algas y levaduras el contenido de aminoácidos es mucho más alto (Kosaric et al 1974, ver Cuadro 2). Ensayos llevados a cabo en ratas y pollos demostraron el alto valor nutritivo que posee y su alta digestibilidad gracias a que posee aminoácidos de cadena simple y una pared celular formada por mucopolisacáridos no tóxicos (Shubert et al 1985).

Cuadro 2: Contenido de aminoácidos de otros microorganismos.

Amino ácidos	*Scenedesmus sp	*Sacharomyces cereviciae
	(microalga)	(levadura)

Cisteína	0.6	0.74
Isoleucina	3.8	4.60
Leucina	8.4	7.00
Lisina	5.7	7.70
Metionina	1.7	1.70
Fenilalanina	5.1	4.10
Treonina	5.1	4.80
Triptófano	1.5	1.00
Valina	5.7	5.30

Esta cianobacteria crece en condiciones alcalinas con un pH que oscila entre 8.5 y 10.5 y a temperatura promedio de 25 a 35°C. La Spirulina platensis puede tolerar temperaturas bajas nocturnas hasta de 18°C. Los medios de cultivo pueden ser: químicos, sustratos convencionales y no convencionales. El medio químico debe ser rico en carbonatos, nitratos y sales, pero los elementos que lo componen son muy costosos y usados sólo en grandes producciones de biomasa de proteína, con tecnologías poco aplicables a nivel del pequeño productor (Ver Cuadro 3).

Cuadro 3: Composición del medio químico (g/litro de solución)

Macroelementos	Oligoelemento

NaHCO₃	*Solución A:
K₂HPO₄	H₃BO₃
NaNO₃	MnCl₂
K₂SO₄	ZnSO₄
NaCl	CuSO₄
MgSO₄	MoO₃
CaCl₂	*Solución B:
FeSO₄	NiSO₄
EDTA (Agente quelante)	TiSO₄
	Co(NO₃)2

La espirulina cultivada en este medio se utiliza especialmente para consumo humano, libre de parásitos y sometida a secado para usar en forma de polvo y venderlo en forma de cápsulas hasta por seiscientos pesos la unidad (Shubert et al 1985).

Los desechos industriales o aguas residuales de las alcantarillas son ampliamente utilizadas para los sustratos de cultivo en la obtención de biomasa microalgal y para purificación de aguas. Se pueden usar: materiales con contenido de almidón, azúcares (mieles de remolacha, caña de azúcar) o sueros. Entre algunos medios no convencionales que evitan altos costos de producción puede usarse eficientemente el efluente de biodigestores anaeróbicos, evitando la contaminación de las fuentes de agua con el lavado del estiércol de los animales, ceniza de la quema de material vegetal con alto contenido de minerales o los lodos de la fermentación alcohólica de las mieles, usados especialmente en Brasil (Ferraz y Aquarone 1985).

El polvo que se obtiene de la Spirulina sp. es una fuente proteica de alto valor biológico sin efectos tóxicos. Posee un 80% de la proteína del huevo, es decir 124 g de Spirulina maxima reemplazan 100 g de la proteína del huevo. No se realizan sustituciones totales de proteína, sino parciales para suplir las deficiencias por falta de fuentes proteicas a causa de los altos costos en el mercado. En dietas humanas se ha considerado como una fuente importante de ácido gamma linoléico, como sustituyente en la alimentación de hipertensos y pacientes con tensiones premenstruales, resultando mas económico que otro tipo de aceites con un costo de trece centavos de dólar por kilogramo (Roughan 1989).

En la Florida existen plantas productoras de Spirulina maxima que abastecen sistemas de cría de hasta 1000 cerdos en base a cultivos con efluente de biodigestores, con sistemas de biofloculación y con producciones de hasta 34 g MS/m²/día con 60% de proteína. Igualmente se ha usado en la alimentación de pollos, proporcionando la suficiente proteína y favoreciendo la coloración del huevo (Lincoln 1985).

La cría de microcrustáceos, moluscos y peces, como consumidores de plancton, requiere procesos de reproducción y cría artificial a gran escala y por lo tanto es de gran interés tener plantas pilotos de producción de la cianobacteria para la alimentación de los primeros estados larvales. Se mantiene en el medio una alta productividad y estos tapetes biológicos constituirían una óptima calidad para el agua, acumulando el oxígeno transfiriendo sustancias metabólicas producidas por los organismos en cultivo.

Favorece la cría de peces ornamentales especialmente ya que la espirulina tiene buen contenido de carotenos y permite mejorar el colorido y vistosidad de estas especies. La cría de microcrutáceos también se ha implementado para el cultivo de peces, pero se ha comprobado que la eficiencia es mayor con las microalgas y cianobacterias. Los moluscos producidos en base a este tipo de alimentación no convencional reducirían los costos de producción y proporcionarían al mercado alimento de alta calidad con mayores ganancias para el productor.

Se han tratado aguas de desecho en base a Spirulina maxima, utilizada como purificadora de aguas residuales que remueve los nitratos, fosfatos, y otros elementos presentes en gran cantidad. En piscinas de oxidación o estanques se pueden obtener dos productos esenciales: proteína vegetal contínua y aguas tratadas y recuperadas, evitando la contaminación y eutroficación activada por la ozonización del agua lo cual permite utilizar el agua para consumo humano.

En Israel se aprovechan las aguas de las costas para producción de microalgas como Spirulina sp. o Scenedesmus sp., tratando de implementar métodos menos costosos y eficientes para el tratamiento de aguas de desecho industriales y domésticas. En Londres se utilizan las aguas de tratamiento terciario de desechos para producir biomasa y purificarlas (Kosaric et al 1978).

Existen numerosos estudios sobre el posible uso de la energía solar, con gran prioridad en numerosos países que poseen tecnología de alto riesgo y mucho costo.

Las cianobacterias, como responsables de la fijación del nitrógeno y producción de hidrógeno con altas tazas de reproducción a través de la utilización de energía solar y agua, mantienen el sistema con técnicas de producción simples adicionando la obtención de biomasa usada en medicina, cosmetología y nutrición.

El objetivo del actual programa de investigación es desarrollar un sistema sencillo para la reproducción de la espirulina, con base en sustratos localmente disponibles. En primer lugar se estudió el uso de los efluentes de los biodigestores y de las destilerías de alcohol (la vinaza).

El ensayo se realizó en el Instituto Mayor Campesino en Buga (Valle, Colombia) con una altitud de 1000 msnm, una temperatura media de 20°C y una precipitación de 1300 mm.

Los cultivos de la espirulina se realizaron en tanques rectangulares (20 cm x 25 cm x 30 cm) de vidrio y fueron agitados con aire de un microcompresor (2,500 cm³ de aire/minuto).

Efluente del biodigestor: Se utilizaron tres tratamientos preliminares correspondientes al medio químico, y efluente mezclado con agua a nivel de 0.5:0.5 y 0.75:0.25 volúmenes de efluente:agua, agregando bicarbonato de sodio en cantidades de 17 g por litro del medio e inóculo de spirulina (192 células/ml) de 200 ml por litro del medio de agua. Las observaciones indicaron que la reproducción fue más eficiente cuando se hizo el medio con partes iguales de efluente y agua.

Con base en esta información, se realizaron comparaciones de cuatro diluciones del efluente correspondientes a volúmenes efluente:agua de: 0.25:0.75, 0.5:0.5, 0.75:0.25 y 1.0:0.0 (ver Cuadro 4). A 1,000 ml de la mezcla se agregaron 200 ml de inóculo de espirulina (192 células/ml) y 17 g de bicarbonato de sodio. Después de 15 días se agregaron otros 1,000 ml del medio (efluente, agua y bicarbonato en las concentraciones usadas en el principio). El efluente se recolectó de un biodigestor plástico de flujo continuo (Solarte 1989), alimentado con excreta de cerdos, con un tiempo de retención de 60 días. El efluente contenía (% base fresca): N 0.10, P 0.03, K 0.07, sólidos totales 2.0.

Cuadro 4: Niveles de efluente usados como medio de cultivo*

	Volumen efluent: Volumen agua
	0.25:0.75	0.5:0.5	0.75:0.25	1.0:0.0

Cantidad de agua (ml)	750	500	250

Cantidad de efluente (ml)	250	500	750	1000

*A cada 1000 ml del medio se agregaron 17g de bicarbonato de sodio y 200 ml de inóculo de espirulina (192 células/ml).

Efluente de destilería (vinaza): Se emplearon tres medios de cultivo suplementados con vinaza residual de la Industria Licorera en proporciones del 0.5:0.5, 0.6:0.4 y 0.7:0.3 volúmenes vinaza:agua. La vinaza contenía (% base húmeda): sólidos totales 60, N x 0.66, K x 0.27. Se adicionó 34 g de bicarbonato por litro de medio y 200 ml de inóculo de espirulina.

Se utilizó el diseño de bloques al azar con dos y tres repeticiones (para efluentes de biodigestor y vinaza, respectivamente) y la evaluación se hizo durante treinta días. Se determinaron a los 2, 15 y 30 días, los siguientes parámetros: conteo de células de cianobacterias y conteo de células de microorganismos por campo de cubreobjetos. A los 30 días se midió el pH, la temperatura y el porcentaje de materia seca del medio.

Durante los primeros 15 días la tasa de reproducción de la espirulina se relacionó directamente con la concentración del efluente en el medio, en el caso del efluente del biodigestor (Cuadro 6). Sin embargo, después de agregar otra vez el medio, fue mucho más marcado la respuesta en el tratamiento de mitad efluente:mitad agua, que con concentraciones mayores, siendo altamente significativas las diferencias (P<.001). La concentración de células alcanzada en 30 días en el tratamiento 50:50 (9 x 10³/ml) todavía no representa el potencial del organismo, ya que concentraciones de hasta 1 x 10⁶/ml han sido reportadas por Noue y Proulx (1986).

La mayor contaminación que presentó el cultivo con efluente del biodigestor fue debida a Chlorella sp. y protozoarios como Amoeba sp. y Paramecium sp.

Los cambios de temperatura registrados entre el día y la noche fueron considerables (desde 23 a 29°C), pero al parecer no afectaron significativamente el desarrollo del cultivo.

El porcentaje de materia seca del producto (6.4 a 6.8%) fue más alto que el que reportaron Nguyen (1982) y Lincoln (1985) (aproximadamente 5%), probablamente debido al contenido de sólidos residuales del efluente en el material.

Quadro 5: Efecto de la concentración de efluente de biodigestor en el medio de cultivo sobre la tasa de reproducción de la espirulina

	Porporción de efluente*
	0.25	0.5	0.75	1	ES	Prob

	Número de células de espirulina/ml :
Lectura
2 días	800	530	540	430	±110	NS
15 días	1310	1380	2220	2700	±280	0.16
30 días	830	9500	3460	4210	±510	<0.001

pH	9.30	9.57	9.35	9.60
(±ES)	(±0.07)	(±0.08)	(±0.07)	(±0.18)

Sólidos totales (%)	6.39	6.80	6.27	6.57
(±ES)	(±1.51)	(±2.65)	(±2.99)	(±2.60

Se realizaron análisis de espirulina en base seca y se obtuvieron los siguientes resultados: N=7.2, P=0.24, K=0.85, Ca=1.02,

Los medios suplementados con diferentes niveles de vinaza presentaron dificultades en cuanto a pH y agitación. El pH de la vinaza es 4.2 luego de pasar por un tratamiento final de ácido sulfúrico para la fermentación alcohólica de las mieles y por lo tanto se aumentaron los niveles de bicarbonato de sodio para aumentar el pH a 7.4 y la agitación fue muy lenta por la alta viscosidad del medio.

Cuadro 6: Efecto de la concentración de efluente de destilería (vinaza) en el medio de cultivo sobre la tasa de reproducción de la espirulina

	Proporción de efluente*
	0.5	0.6	0.7	ESmed	Prob

	Número de células de espirulina/ml
Lectura
2 días	1170	370	460	±160	.06
15 días	2190	1630	2080	±370	NS
30 días	10460	4510	5740	±900	.04

pH	9.04	8.81	8.93
(±ES)	(±0.1)	(±0.01)	(±0.01)

Al parecer, la dilución de partes iguales de vinaza y agua es la mejor, ya que no hubo diferencias significativas en el número de células a los 15 días, siendo menores a los 30 días las concentraciónes de la espirulina con diluciones de 0.6 y 0.7 (P=0.04)(Cuadro 6).

Como puede verse el contenido de nutrientes de la vinaza es mayor que en el efluente pero el contenido de potasio es muy alto, por lo tanto es muy importante la asimilación de este elemento por parte de la cianobacteria para que no sea tóxico para consumo en animales y que a nivel industrial este desecho sea utilizable para otro fin.

Se revisaron las muestras para evaluar el contenido de microorganismos en los medios pero no se encontró ninguno, por lo tanto esto favorece el crecimiento de las células de la cianobacteria por no existir ningún tipo de competencia frente a los medios suplementados con efluente de biodigestor donde la incidencia de microorganismos como Chlorella sp., Paramecium sp. y Amoeba sp. es mayor.

El pH osciló entre 7.40 y 9.04, lo que muestra que la Spirulina maxima puede resistir un pH extremo como lo hace la Spirulina subsalsa Oersted de Costa Rica (Hargaravez y Viquez 1982). Las temperaturas tomadas para estos cultivos mostraron máximos de 29°C y mínimos de 23°C en las noches y el promedio calculado fue de 24.6°C. No se presentaron diferencias significativas entre los tratamientos respecto a la temperatura (Ver Cuadro 6).

Al parecer, el nivel de efluente de biodigestor más recomendable para el cultivo de Spirulina maxima es una combinación de partes iguales de efluente y de agua (sin cloro) con 17 g de bicarbonato de sodio por cada litro de medio, teniendo en cuenta que el efluente tendría una concentración de sólidos de aproximadamente 2%.

El nivel de vinaza más efectivo para la reproducción de la cianobacteria fue del 50% de vinaza y 50% de agua. En este caso fue usado 34 g de bicarbonato de sodio por cada litro de medio, en vista de la acidez de la vinaza.

La población de células de espirulina posiblamente fué afectada básicamente por la competencia de microorganismos cuando se usó como sustrato el efluente, de ahí la ventaja de la suplementación con la vinaza.

El pH y la temperatura para los ensayos, tanto de efluente como de vinaza, no variaron significativamente como para afectar el cultivo de espirulina.

Realizar más ensayos para tratar de aumentar los niveles de suplementación con efluente y vinaza.

Buscar otras alternativas para uso de desechos como sustrato para la espirulina, además de emplear elementos químicos como el carbonato de calcio para suplir las necesidades de carbono.

Hacer énfasis en la implementación del cultivo de la cianobacteria a nivel de campo, dando más importancia al análisis de los sustratos para el cultivo y las tecnologías aplicadas para el pequeño productor.

Ferraz C A M y Aquarone C 1985 Utilization of by-products from alcoholic fermentation industry to biomass production of Spirulina maxima. Part 2. Use of molasses alcohol distillate waste. Reviews in Microbiology 17(1).

Hargaravez y Víquez 1982 Spirulina subsalsa Oersted en Costa Rica. Estructura y posible importancia comercial. Mimeograph.

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Lincoln E 1985 El uso de microalgas en la producción porcina. Universidad de Florida, Gainesville (Mimeograph)

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Roughan P G 1989 Spirulina: a source of dietary Gamma Linoleic Acid. Journal Science Food and Agriculture 47:85-93.

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Solarte A J 1987 Experiencias con los biodigestores plásticos de flujo continuo. Reporte de Investigación. 1:89-93 (CIPAV;Cali)